背
景
前列腺癌是一种常见而复杂的恶性肿瘤，严重威胁男性健康。全球范围内，前列腺癌占男性肿瘤年新发病例第二位，死亡原因第五位。初诊的前列腺癌大多对雄激素剥夺治疗（ADT）敏感，但随着病程进展，几乎都会进入预后较差的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）阶段，尤其是转移性去势抵抗前列腺癌（mCRPC）。同源重组修复（HRR）是DNA双链断裂的重要修复途径，HRR相关基因突变会导致基因不稳定并促进肿瘤生长。研究显示，在mCRPC患者中，HRR基因突变大约占到20%-30%。既往研究提示PARP抑制剂在HRR突变的mCRPC中显示了抗肿瘤活性与安全性。
PROfound研究是第一个在前列腺癌领域利用分子分型指导靶向治疗的阳性结果Ⅲ期临床研究，不仅为PARP抑制剂在前列腺癌的治疗提供了有力的临床证据，也为前列腺癌的基因检测方法进行了全面的探索。尽管肿瘤组织样本是分子检测的金标准，但在临床诊疗中因为样本质控问题难以常规开展检测。临床上适合NGS分析的样本类型优选新鲜组织标本，也可选用FFPE样本、肿瘤细胞学样本及血浆（游离DNA/RNA）等。对于新鲜组织，可采用冷冻切片染色评估样本中的肿瘤细胞含量，对于FFPE样本，制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色评估肿瘤细胞的含量。除了样本组织类型，其他因素也会影响NGS结果。年发表在ClincalCancerResearch(IF:12.)的一篇文章报道了PROfound研究中多名接受筛选的mCRPC患者肿瘤组织样本基因检测情况，讨论了真实世界中分子检测所面临的困局。
研究方法
研究纳入携带1-15个HRR基因突变、既往经二代抗雄激素药物（恩扎卢胺、阿比特龙）治疗进展的mCRPC患者。根据基因突变类型不同，分为两个队列。队列A患者至少携带BRCA1、BRCA2或ATM基因突变其中之一，队列B至少携带其他12个基因突变（BRIP1、BARD1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCL、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L）其中之一。
研究结果
1、患者样本检测情况
在20个国家的个地方，总共对名患者进行了初步筛查。FMI接收了名（92%）患者的样本；名（8%）筛查的患者没有样本。在名有可用样本的患者中，名（99.5%）符合检测条件（即进行检测过程的第一步，病理评估）；另外22名（0.5%）患者不符合检测条件。符合检测条件的名患者中部分患者提交了多个样本，最终收集到个符合条件的样本。58%（/）的样本获得了NGS检测数据。
2、NGS结果分析
在样本水平上，存档的活检样本获得NGS结果的比例（56.9%）略低于新活检的样本(63.9%)（图1A）；原发灶样本（56.2%）略低于转移灶样本（63.9%）。不同样本形式（蜡块vs切片）的NGS检测成功率无显著差异。从样本组织来源看，骨样本最低(42.6%)，淋巴结样本的NGS检测成功率最高（74.7%）（图1B）。不同采样方式对应的NGS检测成功率依次为：前列腺CNB52.4%、TURP69.8%、根治性前列腺切除术74.0%、环钻活检86.7%（图1C）。与既往研究结果一致，新近收集的样本获得NGS结果的比例更高，检测成功的概率随着样本存档时间的增加而逐渐下降。X2检验结果显示，久远年限样本与NGS检测失败的概率显著相关(P0.)：小于1年的样本中68.1%(95%CI，65.0-71.1)可获得NGS结果，而大于10年的样本获得NGS结果的概率为47.3%(95%CI，43.0-51.5)（图1D）。通过肿瘤纯度（细胞核）、总组织体积和DNA产量对NGS结果生成的分析表明，随着肿瘤含量和DNA产量的增加，NGS检测成功的比例增加（图1E-1G）。
图1.个肿瘤样本的临床特征
3、未获得NGS检测结果的原因分析
获取的例样本在免疫组化、DNA提取、构建文库、生信分析等步骤中都存在一定失败的比例，如图2A。存档的样本有21.3%的比例是在DNA提取阶段失败，而最新获得的样本更有可能在病理质控阶段（肿瘤细胞含量较低）失败，如图2B。针对不同的取样方式，NGS检测失败的原因也不完全相同，根治术标本通常肿瘤细胞含量较高，可以达到病理质控标准，但由于其多为存档样本，DNA质量通常较低。
图2.样本处理各阶段失败原因分析
4、影响NGS检测结果的因素的分析模型
为了确定获得NGS检测结果的影响因素，研究者设计了一项逻辑回归模型，如图3所示，该模型包含的变量有样本类型、样本储存年限、肿瘤纯度、DNA产量等。DNA产量是影响NGS结果的主要变量(AUC=0.)；其他变量，如样本储存年限(AUC=0.)和肿瘤含量(AUC=0.)也有潜在的影响。
图3.影响NGS检测结果的因素的逻辑回归模型
总结
PROfoud研究表明，基因检测来识别HRR基因突变是可行的。送检的样本会经过病理评估、DNA质量评估、测序质量评估等严格的质控步骤，每一步都会有一部分样本因质控不合格而无法获得NGS结果。样本储存年限、肿瘤纯度和DNA产量是影响NGS结果的三大要素。如果有多个样本，当这些样本的肿瘤纯度相近时，则考虑选择较新鲜的样本。对于储存年限超过5年的样本，则考虑使用肿瘤纯度最高的样本，或者样本来源为淋巴结等肿瘤细胞含量较高的组织。对于新收集的样本，使用福尔马林固定和避免脱钙处理（对于骨组织样本）有助于保持核酸的完整性。高质量的肿瘤组织样本是获得NGS结果和筛选可能从奥拉帕利治疗中获益的mCRPC患者的关键。
裕策生物NGS检测质控流程
目前NGS检测的样本来源主要为组织、细胞、体液，收集的样本需经过前处理、核酸提取、核酸质控、文库构建、文库测序、数据分析等步骤。裕策生物旗下深圳裕康医学检验实验室（以下简称：裕康医学实验室）有着严格的质控标准，曾在多次室间质评中获得国际认可。
近日，裕康医学实验室病理图像判读水平获得CAP认可，为患者提供准确客观的病理诊断结果，从而使更多肿瘤患者能够获益，为精准诊疗保驾护航。
裕策生物NGS检测流程
CAPNEO-A成绩单
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参考文献：MahaHussain,ClaireCorcoran,CarolineSibilla,etal.TumorGenomicTestingfor4,MenwithMetastaticCastration-resistantProstateCancerinthePhaseIIITrialPROfound(Olaparib).ClinCancerRes()28(8):–.DOI:
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