免疫组化是门很复杂的学问，同时也是一场浩大的工程。在常规的生化实验当中，说它是最复杂的小实验也不为过，真正诠释了细节决定成败。当然，免疫组化的概念其实很大，本文所提及的只是免疫组化中的免疫荧光化学。
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冰冻切片or石蜡切片
免疫组织荧光，一定首选冰冻切片而非石蜡切片。两者的区别主要在于冰冻切片能较完整地保存抗原免疫活性，但组织结构会受到冰晶等的影响而变形，石蜡切片则相反。虽然石蜡切片可以做抗原修复，但是，它不是麻烦嘛！所以想听冰冻切片做免疫荧光的故事，请继续拜读，啊呸，垂阅下文。
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灌流和固定
4%PFA动物心脏灌注。
如今实验动物多为啮齿动物，以SD大鼠为例：
麻醉，固定头和四肢，开胸腔，暴露心脏，灌流针插入左心尖（也就是左心室），右心耳剪个小口同时打开蠕动泵开关开始灌流，先PBS后PFA，最后解剖目标组织于4%PFA中浸泡，4度24h。
麻醉和开胸腔不用说。灌流针插入心尖的时候，理论上应插到主动脉附近，但实际上此操作很容易插错从而进入肺循环导致灌流失败，所以此时可以使针尖刚刚穿过心尖到达左心室即可。接着，右心耳剪口，开启灌注，两者保持一致。
注意，灌流时管道不允许有气泡。PBS灌流结束标志以肝脏变白和流出澄清液体为准，PFA灌流成功标志位肝脏变硬为准，灌得好的大鼠四肢会抽搐几次，成年SD大鼠mlPBS和mlPFA足矣。
现今灌流多为PFA，没有争议，但有人提出将PBS和PFA4℃预冷再进行灌注效果更好，我没有试过，但我觉得室温亦可。也有人做免疫组化不需要灌流，但那都是小组织，一般情况，灌一定是比不灌固定效果要好的。
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脱水
10%，20%，30%蔗糖的PBS溶液梯度脱水。
脱水这一步直接关系到后面切片的冰晶的形成，脱水脱不好则冰晶较多，片子空洞较多，结果相当丑。此时应使溶液的体积超过数倍于组织的体积，沉底即可换液，直到组织块在30%的蔗糖溶液中沉底。沉底后就不要放置太长时间了，应迅速进行下一步。
也有人直接用30%蔗糖溶液脱水，不过直接用高浓度溶液脱水极易引起组织皱缩、变形而影响切片。当然我对比过两种方式其实区别不大，但我还是建议梯度脱水，因为谁也不能保证在你自己的实验条件下也差别不大，况且高浓度直接脱水沉降时间会很长，其实没有节省很多时间。
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包埋
组织块修好后放入合适的包埋盒，加入OCT包埋剂，液氮或干冰速冻，放入-80冰箱保存。
现在普遍用OCT包埋剂（optimalcuttingtemperature
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