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实验笔记丨免疫组织化学染色IHC步骤

来源:石蜡 时间:2022/8/5

免疫结构化学(Immunohistochemistry,IHC)是操纵抗原与抗体稀奇性连系的道理,经过化学反映使标识抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来肯定结构细胞内抗原(多肽和卵白质)。

包埋结构

在4%多聚甲醛溶液中牢固结构48小时后,放入一次性结构包埋盒中脱水,浸蜡后包埋。

修片

修剪白腊切片,直至将白腊切片修到大部份结构在切面上。

组化

3.1蜡块制备

将结构蜡块提早泡到冰水搀和物中使其变软,将结构蜡块放在切片机上切出5微米的切片,60°C烘片1小时。

3.2脱腊:

1)将切片放到60°C烘箱中烘片4h以上。

2)在二甲苯I里置入电影,贯通0.5h,再置于二甲苯II,仍然贯通0.5h。

3.3水化

1)经过酒精,浸泡切片,酒精浓度不一,分为70%、80%、90%、95%、100%,各浓度浸泡时候也有所差别,前3个浓度都是各自浸泡2分钟,背面两个浓度别离浸泡5分钟、10分钟。

2)着末将电影放到双蒸水中浸泡2min。

3.4组化

1)封锁收拾:抉择内源性过氧化物酶阻断剂,收拾时候为20min。

2)用双蒸水浸泡三次,单次时候5min。

3)抗原修理:打算pH=6.0的10nM柠檬酸抗原修理液-ml,把电影放到内部,用保鲜膜封住烧杯口避免沸腾溢出。以后放到微波炉顶用高火加热10min。

4)加热后用双蒸水补齐液面,在微波炉中加热40min(中低火至解冻之间),每隔10min用双蒸水补齐液面。

5)修理完毕后,放到室温下,使其天然冷却。

6)DDW洗刷"以后,经过PBS洗刷,3分钟/次,实行三次。

7)经过一抗封锁,维持4°C,第二天实行温度上升,为37°C,尔后经过PBS洗刷,贯通5分钟。

8)在个中增加反映巩固液,尔后孵育,室温前提,贯通20min,再经过PBS洗刷,3分钟/次,实行三次。

9)介入巩固酶标山羊抗小鼠/兔IgG会合物,尔后孵育,室温前提,贯通20min,再经过PBS洗刷,3分钟/次,实行三次。

10)滴加DAB显色液(现用现配、比例1:19),室温孵育2-10min(按照不同的抗体自行抉择染色时候)。用自来水悄悄洗刷掉。

11)复染:加苏木精染色50s。用DDW,3min,PBS,5minX3次。

12)脱水:将电影次第浸泡到不同浓度的酒精梯度中:70%,lmin—80%,lmin—90%,1min—95%I,5min—95%II,5min—100%I,5min—100%II,5min。

13)通明:操纵二甲苯I、二甲苯II实行收拾,屡屡收拾贯通20min。

14)中性树脂封片,中性树脂,加盖玻片(结构部位切勿残留吝啬泡),天然晾干。

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