北京中科白瘕风级别 http://pf.39.net/bdfyy/bjzkbdfyy/index.html空间转录组（ST-seq）技术不仅可以提供研究切片的表达量信息，还能提供组织的空间定位信息，对肿瘤学、神经科学、发育生物学、免疫学、病理学等众多领域的研究都具有重要意义。空间转录组自从年4月底由10XGenomics发布福尔马林固定并石蜡包埋（Formalin-FixedandParrffin-Embedded，FFPE）样本的方法后，该技术再度高频出现在生命科学领域的研究者视野中，主要原因是FFPE增加了空间转录组的兼容性，主要体现在FFPE样本相比于FF样本具有增添空间转录组样本切片制备的方法和基因检测更灵敏的特点。两种切片方案的详细介绍链接：FF方案详细介绍：《空间转录组的包埋实验与注意事项》FFPE方案详细介绍：《FFPE样本也能做空间转录组？快来看看怎么实现吧》当两种可行性方案摆在我们面前时，我们很容易形成困扰——哪一种方案更好呢？哪一种方案更适合我呢？下面我们就将对两种技术进行直观比较，解决一下你的“选择困难症”。一、FF和FFPE的切片技术比较FF和FFPE是病理和组织学研究中使用最为广泛的两种制片技术，但是两种制片本身在制片的适用性上就存在一定的区别，各有优劣，这也是如今病理研究领域两种切片并存的重要原因。所以，要选择方案，首先需要了解一下这两种制片技术有什么不同。第一，制片复杂度。冰冻切片（FreshFrozen,FF）相比于石蜡切片简单易行，冰冻切片一般进行（固定、脱水、）包埋、切片即可，一小时内即可完成，而石蜡切片包含固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片步骤，需要8-10个小时实验时间，所以石蜡切片的制片步骤更为复杂。第二，样本保存能力。FF切片技术主要应用于手术中快速病例诊断，这就要求制片过程简单、快速才行，样本缺乏充分的脱水和固定，因此在保存过程中还是会出现脱水、氧化等现象使组织发生形变，包埋的组织很难得到长久的保存；而FFPE切片技术主要用于常规制片，经过复杂工序去除样本水分并以不溶于水的石蜡对组织进行隔绝保护，可以很好防止样本氧化，组织也因此得到更持久的保存，因此很多珍贵样本都是以石蜡包埋的方式进行保存。第三，分子完整性。冰冻切片在低温下能够较好地保存组织切片中的mRNA分子完整性和抗原免疫活性，在做表达量捕获时直接通过透化的方法释放mRNA分子，同时在做免疫组化时不需要抗原修复这一步；而石蜡切片在高温下制片，并且制片步骤繁杂，就会使得mRNA分子容易降解，抗原免疫活性也会降低，不过这也不用担心ST-seq建库中捕获不到mRNA，因为对于FFPE的样本使用了探针捕获的方式进行建库。第四，细胞完整性。冰冻切片在样品冰冻时进行，组织内部就会容易形成冰晶，对切片完整性或细胞完整性有较大影响，从而增加切片难度，同时影响抗原定位；而石蜡切片虽然制片步骤繁杂，但是得到的切片组织结构保存较好，能连续切片，组织结构清晰，细胞定位准确，抗原定位准确，可将病理学研究延伸到空间组学上。表1两种制片方法的技术比较二、完成切片后的实验操作和建库比较完成切片后的实验操作围绕的核心问题是如何原位高通量捕获mRNA，两种方案的制片差异也就导致了后续实验的差异。第一，mRNA捕获方式不同。VisiumFF切片的mRNA完整性好，有polyA尾保留，所以我们可以直接通过poly(dT)对mRNA进行捕获。而FFPE样本由于存在不同程度的mRNA降解或者片段化，poly(dT)的捕获效率低，所以采用探针杂交的方式对基因进行标记，然后通过对探针的定量来还原基因的表达情况。第二，文库构建方式不同。VisiumFF对mRNA的捕获是获取的cDNA，因其长度我们需要打断后才能添加测序接头，这中间需要较多步骤的打断、修复、添加接头的PCR和纯化反应，耗时较长。而VisiumFFPE的探针系统本身已经是短片段，捕获后茎PCR扩增至足够量即可添加接头序列，建库时间明显缩短。图2Visium空间基因表达工作流程比较表2Visium空间转录组技术的整体建库测序流程上的比较三、两种切片的选择建议Visium空间转录组技术的两种切片方法各有优势，不管是从切片制备方法上，还是整体的建库测序流程上都有各自优势。那对于这两种切片技术该如何选择的问题上，一般推荐FFPE技术主要针对已制备好的FFPE样本、珍贵的FFPE样本等进行回顾性研究、纵向研究、追踪生物过程等方面；新鲜组织冰冻切片技术则主要是使用新鲜组织进行切片和后续建库测序，因为冰冻切片技术相比于FFPE具有操作过程简单、耗时短等优势，可以避免操作过程中的RNA降解，提高样本的切片制备的效率，缩短项目周期。因此，基于冰冻切片的空间转录组技术优势，也不推荐大家使用新鲜组织去做FFPE样本，从而避免样本制备过程中的风险。同时，对于已经完成制片的FFPE珍贵样本，可直接进行VisiumFFPE空间基因表达检测，因为FFPE方案的建库流程与FF相比显得更加流程化和简单化，建库操作也简单。四、基迪奥的ST-seq项目经验基迪奥在两种的使用方法上也是积累了相当丰富的项目经验（只列出部分），如果您还是不清楚该如何进行抉择，不妨联系我们的销售进行深入交流。表3基迪奥空间转录组测序的组织类型经验清单
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