类器官样本制备及原位检测服务简介

年1月28日，国家科学技术部发布「十四五」国家重点研发计划中指出，类器官作为一项重大的技术突破可被用于疾病模型的建立中，以挖掘疾病诊疗的新靶标，探索诊疗新策略。年12月，国家药品监督管理局药品审评中心（简称CDE）发布了三个与基因治疗相关的指导原则，其中《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》文件中，明确指出类器官可作为非临床研究动物模型的替代性模型；而在《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》文件中，指出类器官可以作为有效性和安全性评估模型。由此可见类器官作为药物以及基因治疗的研发以及安全评估模型，获得了国家药监局药审中心的认可，成为相关药物研发以及安全评估中重要的一环。

类器官是由器官特异性的成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而成自我组合的3D细胞簇，能复现组织和器官的某些特性和功能。目前，研究人员模拟各种组织类型构建了多种类器官，在多个领域叱咤风云：包括发育生物学、精准医学、疾病建模、再生医学、毒理学、药物开发、基因编辑、多组学研究等。[AmJPhysiolCellPhysiol.Jul1;(1):C-C]

类器官实验过程中使用到的检测方法

使用类器官实现CDE描述的相关功用，大致分为两个阶段。上游包括采用不同来源的干细胞，通过培养基以及多种细胞因子培养获得所需的类器官类型，例如肝脏类器官，肠道类器官，或者肿瘤为代表的疾病模型类器官；下游则包括使用这些类器官进行生物学功能，药物有效性，安全性，毒性等研究评估。

在上游阶段，即类器官培养形成过程后，需要对类器官是否达到要求进行评估。这些评估涉及到众多原位检测需求，包括但不限于：

类器官内细胞的分化增殖情况（可以通过细胞核的ki67等相关蛋白的免疫组化或者免疫荧光判断其在细胞中的分布和占比）；

类器官内细胞的种类（通过免疫组化，免疫荧光，多重免疫荧光以及RNA原位检测判断每种细胞类型特有的靶标的转录和表达以及共定位）；

细胞的空间位置分布关系；

组成类器官的细胞是否具有相应的生物学功能（通过RNA原位杂交法检测功能细胞是否具有相应细胞因子的分泌功能）；

是否具有特定基因的扩增或者融合等特性（例如疾病或肿瘤类器官内通过DNAFISH或者RNA原位杂交法检测HER2扩增，MET外显子跳跃，EGFR点突变，ALK融合等相关基因水平改变）等。

下游阶段，即在使用了相应的化合物，药物或病毒等外源物对类器官进行处理后，需要：

对类器官内不同细胞生物学反应（如使用免疫组化法对加入SARS-CoV-2病毒到小肠类器官内的ACE-2等受体表达变化进行判断）；

细胞的增殖和死亡情况（如使用免疫组化法监测抗肿瘤药物应用后肿瘤类器官内肿瘤细胞与非肿瘤细胞的凋亡以及增殖差异）；

药物的杀伤特异性（如使用多重免疫荧光法对不同种类细胞靶点进行监测，判断肿瘤细胞以及非肿瘤支持细胞的分布比例）；

药物处理后残留细胞的特性（如使用DNAFISH或RNA原位杂交法检测药物处理后细胞内特定基因的突变情况或者是否有肿瘤干细胞存活）等。

当然，除了原位检测方法外，还有多种非原位分子检测手段，例如PCR法，ELISA，NGS或scRNAseq等应用于评估从类器官获得到应用多个环节。

类器官原位检测的难点和解决方案

虽然类器官是由复合细胞组成，但是相较于常规动物取材获得的器官样本（例如小鼠，大鼠或者病人手术样本，通常直径几厘米到几十厘米），类器官体积远小于前者。一般类器官的直径从几十到几百微米不等，属于微小组织样本。顾名思义，微小组织样本由于体积过小，很难像常规的组织样本那样进行标准的组织包埋流程，极易在包埋过程中由于体积过小而丢掉，即使成功的包埋在石蜡块中，也通常由于体积过小而不容易定位以及制备切片。

除了以上的问题，对类器官样本进行冰冻切片还是石蜡切片的选择，也决定着研究的持续性和可追溯性。科研角度目前使用到的冰冻切片比较多，该法的优势是制备方法相对简单，能够尽快在实验室完成切片以及后续的检测；但是其缺点是样本组织块以及切片缺乏常温稳定保存的可能性，且如果是对样本内的RNA进行检测，对保存时间和条件的限制更为苛刻。将类器官制备成石蜡样本的优势是可以较长时间常温稳定保存样本，石蜡块由于其常温下稳定性，可以室温下经年到数年保存，对于需要可追溯性研究或者需要存档建库的类器官样本更具有优势。同时，对比冰冻切片和石蜡切片，组织细胞的形态后者要优于前者，尤其对于例如多重免疫组化以及DNA、RNA原位杂交这些需要多步试剂操作的检测，石蜡切片的检测结果更优。

通常情况，受到技术条件限制，冰冻切片通常较厚，达到10微米到20微米之间，而石蜡切片可以达到在4-6微米。综合细胞平均直径，石蜡切片获得的细胞多为单层细胞，免疫组化检测以及DNA或者RNA原位检测时，抗体和探针更易进入到细胞内，结果采集对显微镜聚焦要求偏低，比较容易获得较好的检测效果；冰冻切片可达到1~2层细胞，对于样本预处理条件，抗体的浓度，检测信号的采集方法等与石蜡切片相比，均有所差异。

虽然石蜡和冰冻样本都可以用于类器官的样本制备，且前者具有一些特有的优势，但是目前市场上进行类器官石蜡包埋及切片的研究十分有限。究其原因，主要与类器官石蜡样本制备的复杂度有关。如前所述，作为微小组织样本，类器官本身在操作上就有较大难度，且石蜡样本制备的整体流程要比冰冻样本复杂，需要较多环节以及一些专业设备完成，故成为类器官石蜡样本制备的限制因素。

北京卓鼎生物提供类器官石蜡样本制备、切片、免疫组化染色（IHC,IF）、多重免疫荧光染色（multipleximmunofluorescence,mIF），RNA原位杂交（RNAscope）以及DNA原位杂交（FISH）服务

作为一家病理相关试剂和服务公司，北京卓鼎生物科技有限公司常年来致力于病理相关试剂的销售以及高质量的病理服务输出。通过使用我公司专有的CellGel微小样本处理凝胶，我公司已经成功为国内众多高校（浙江大学，广州医科大学等）以及多家药厂提供了多种类型类器官的石蜡样本制备，切片，以及后续染色服务。通过使用CellGel微小样本处理凝胶的试剂优势，我们可以将微小样本固定于局部区域，且肉眼可以清晰容易定位该区域，方便后续的石蜡切片以及相应的检测。如下图1红色箭头所示的区域为使用了CellGel处理的类器官组织在石蜡块中的定位，可以帮助研究者准确进行定位。在此基础上，我公司的服务平台拥有十年以上病理操作经验的技术专家常年提供病理切片，染色，结果分析等相关服务。针对类器官我们除了石蜡样本制备外，也提供了众多下游病理染色服务。如下图2所示，为我公司服务平台为客户制备的石蜡类器官并切片后，进行了HE染色，免疫组化染色以及RNA原位杂交染色（RNAscope法）的结果例图。

图1.CellGel包埋的微米直径类器官制备成的石蜡块。箭头所示为CellGel包埋的类器官所在位置

图2.CellGel包埋的类器官石蜡样本的HE染色例图（左图），免疫组化染色阳性结果例图（DAB法，中间图），RNA原位杂交阳性结果例图（RNAscope法，右图）

除了以上常规检测外，公司还具有多重免疫荧光（mIF）染色平台，包括优化的mIF染色试剂和染色方法以及荧光扫描设备，可以提供类器官的多重免疫组化染色及结果采集，分析服务。可以在一张切片上同时观察到类器官内不同类型细胞的数量，分布，空间位置关系以及生物学功能等多种信息。

关于我们

北京卓鼎生物科技有限公司是一家致力于病理实验用产品生产、开发以及技术服务的生物科技公司。公司常年提供高质量的产品及服务，并与多家国际知名药厂、诊断试剂公司以及生物科技公司有密切合作。