这是医业观察的第-7期文章
来源：生信语滴
01
前言
基因融合是由原本两个独立的基因形成的杂合基因，一般发生在基因组层面，根据融合断点位置的不同，有些基因融合会发生转录有些则不发生转录，除了基因组上会发生融合外，在转录本层面也会发生基因融合现象；当然需要补充的是有一些基因会和基因间区发生融合，理论上基因间区断点融合不太可能起作用，但是已有研究发现基因间区断点融合是可能被激活的。
融合基因最初是在血液肿瘤中发现的，由于检测技术的不断发展，目前基因融合已经在实体瘤中被广泛发现，由于其在肿瘤中有着特异性的表达，融合基因已经在治疗靶点和肿瘤诊断中得到应用；
目前已经有15款肿瘤NGS检测试剂盒获批，15个试剂盒中有12个包含了融合检测，可见基因融合在肿瘤伴随诊断中的重要性。
02
基因融合检测技术
目前常见的基因融合检测分子病理检测方法包括：荧光原位杂交（FISH）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫组织化学（IHC）、二代测序技术（NGS）等。其他技术平台，如数字PCR、Nanostring等也逐渐成熟，有待进入临床应用积累更多的临床实践经验。
1.FISH（荧光标记原位杂交）
FISH基于DNA层面检测基因融合，目前FISH仍然是检测基因易位/融合的“金标准”，它主要基于分离探针的使用，不需要已知融合基因的伙伴，利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子杂交，通过观察荧光信号，来确定目的基因分离或融合状态。
FISH方法可以在保留细胞、组织完整的情况下，通过显微镜直接观察结果，直观可靠；另外FISH方法对组织的肿瘤含量要求不高，但是这种方法通量较低，一次只能检测一个靶标，当需要检测多个基因的融合时则要进行多种FISH探针的检测，目前没有商业化的探针，有显著的假阳性（FP）或假阴性（FN），且检测费用高。
2.IHC（免疫组织化学）
IHC基于蛋白层面检测基因融合，利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的检测技术；
IHC与目前的现有分子检测方法相比更经济、更快速，但是结果判读时存在一定的主观性，对弱阳性结果的判断需要进一步用FISH等技术来验证。
3.RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）
RT-PCR可以在RNA水平上高度敏感地检测融合转录本，不过只能检测一些已知的基因融合形式，无法检测未知融合，这种方法受到RNA质量的影响较大，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本的RNA质量通常较差，所以有可能造成一些假阴性的结果。
4.NGS（二代测序技术）
NGS方法检测基因融合根据分析水平可以分为：DNA或RNA；从检测范围区分可以分为：全基因组（WGS）、全转录组测序（WTS）和目标区域富集测序（panel）；
WGS是目前普遍认可的一种测序方案，可以识别所有已知和未知基因融合，并且可以定位到具体的基因组位置。然而，它需要大量的起始投入量并且平均测序深度通常很低。WTS测序可以检测已知和未知的表达基因融合，它比WGS更敏感，但肿瘤临床样本中的RNA在质量和数量上都不足以进行这种类型的分析。在临床实践中，WGS和WTS都不是最优选择，因为这些方法昂贵、耗时且需要复杂的数据分析流程。
靶向panel是临床中使用最多的测序方案，需要较少的起始投入量，分析也是基于有限数量且临床有价值的目标基因，比WGS和WTS更快，数据分析和结果解读更容易。用于基因融合的DNA或RNA靶向panel可以是基于杂交捕获或扩增子这两种富集方式。杂交捕获方法通过与目标区域互补探针的杂交步骤进行基因特异性富集，而基于扩增子的方法依赖于针对目标区域设计的特异性引物的多重PCR。
A.杂交捕获；B.经典扩增子方法；C.锚定多重PCR
03
基因融合产品案例
目前通过NMPA审批通过的12款包含基因融合的试剂盒我们可以看出目前临床上面使用的融合检测方法主要分为两个流派：
1.基于半导体测序法测序法的RNA样本多重扩增方法
2.基于可逆末端终止测序法或联合探针锚定聚合测序法的DNA样本探针捕获方法
以上获证的厂家有多个是走的创新医疗器械途径，技术资料已经公开似乎已经没有什么新鲜东西了，今天我更愿意选择一家技术方案稍微特别一点的公司产品唠一唠，这家公司同样走了创新医疗器械，于21年3月药监局特别审查公示，遗传办查到的更新信息为年2月进入临床实验，了解注册的朋友应该都知道创新医疗器械需要申请人有相关的发明专利的，这是我解读产品的重要信息来源。
钻石靶点-NTRK融合检测方案
该试剂盒提供一种用于检测NTRK基因家族融合基因的探针库，这个探针库包含两个探针群，第一探针群用于DNA层面检测捕获、第二探针群用于RNA层面检测捕获。
可被检测的融合基因包括：NTRK基因家族包括的基因中的任意一个与AFAP1、AGBL4、ARHGEF2、BCAN、BCR、BTBD1、CD74、CHTOP、EML4、ETV6、IRF2BP2、LMNA、MPRIP、MYO5A、NACC2、NFASC、P2RY8、PAN3、PLEKHA6、PPL、QKI、RBPMS、SCYL3、SQSTM1、SSBP2、STRN、TFG、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRAF2、TRIM24、TRIM63、VCL、ZNF、AMOTL2、IRF2BP2、AKAP13、PRDX1、SLC25A44、RRNAD1、MEF2A、WDR72、TNIK以及SEMA6D中的任意一个基因融合得到的融合基因。
采用gDNA测序数据进行生信分析得到DNA层面的融合信息，采用cDNA测序数据进行生信分析得到RNA层面的融合信息，将DNA层面的融合基因和RNA层面的融合基因结合进行可靠性判断而得到阳性融合结果；
可靠性判断如下：
当DNA层面和RNA层面分别检测的融合基因的检测结果一致时，所得融合基因对即为阳性融合结果；
当DNA层面和RNA层面各自检测的融合基因结果不一致时，则分别判断DNA层面或RNA层面分别检测的融合基因是否为公共数据库已知的融合基因，将判断为已知的融合基因，判断为阳性融合结果，若判断结果都为非已知融合基因，则以RNA层面检测出的融合基因为阳性融合结果。
“最后这一句有点歧义，没有完全看懂”
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TheEnd
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