高通量测序(NextGenerationSequencing，NGS)手艺因其通量、成本和效率等各方面的上风，在肿瘤、遗传病及病原微生物探测范畴表现着越来越紧急的效用。跟着关连临床协商的赓续深入，战术准则的带领与完竣，进一步促使了该手艺在院内内陆化的运用。“玩转NGS熟练室”专栏旨在从多角度探究NGS手艺院内内陆化运用的关连楷模、运用项目及紧急进步，促使NGS手艺的临床变化。
当前高通量测序手艺可探测的DNA或RNA模范紧要滥觞于患者的结构、细胞或体液。固然滥觞不同，但在举行高通量测序探测时关节不异，需求过程模范猎取及处置—核酸索取—核酸质控—文库建设—文库测序—数据解析等关节。此中针对不一模范范例、不同核酸范例（DNA或RNA），在模范猎取、处置、核酸索取关节有必然差别。本篇将要点针对模范猎取及处置关节的详细请求伸开引见。
模范的搜罗、处置及储蓄办法对高品质的测序终归相当紧急。适当临床NGS解析的模范范例优选新鲜结构标本，也可采用甲醛不乱-白腊包埋（Formalin-FixedandParrffin-Embedded,FFPE）模范、肿瘤细胞学模范及血浆（游离DNA/RNA）等[1]。关于肿瘤体细胞变异初度NGS探测时应首选经病理评估过的结构模范，在此根基上的再次探测可采用液体模范动态监测[2]。接纳过靶向/免疫药物调节的患者，应尽或许运用调节后的模范，以追寻调节后新呈现的耐药渐变[1]。
图1非小细胞肺癌患者罕见靶向调节关连基因探测过程[3]
各种模范搜罗及保管
1
手术和活检的新鲜结构
搜罗请求：猎取的模范应含有充盈肿瘤细胞，手术取样后用生理盐水冲刷至结构表面没有显然血印，避让血液中gDNA浑浊。范围炎症严峻的肿瘤、粘液形成太高的肿瘤、病变核心普遍纤维化的肿瘤细胞不能搜罗，免得形成假阴性终归（手术搜罗的肿块结构不低于50mg（豌豆粒巨细）。穿刺模范应≥2条，长度≥0.5cm。新鲜模范中肿瘤细胞的比例不该低于20%）[1],[4]。
处置办法：赶快置于液氮或保管在模范掩护剂中，及早变化到液氮罐或-80℃冰箱（保管在模范掩护剂中的模范，需遵循掩护剂请求的保管前提举行保管）。该历程应在手术离体后30min内实现，以避让RNA等核酸降解[5]。
评估办法：可采取冷冻切片染色评估模范中的肿瘤细胞含量[1]。
图2左：液氮罐右：液氮罐内提桶（用于液氮的掏出及模范的保管）
2
FFPE模范
搜罗请求：按病理操纵楷模举行取材。只管避让肿瘤细胞过少或未探测到的肿瘤结构、病变核心普遍纤维化的肿瘤、粘液形成太高的肿瘤、范围炎症严峻的肿瘤、含坏死结构过量的肿瘤、含钙化灶并脱钙处置过的肿瘤（结构模范中肿瘤含量提议应抵达20%以上，最好含量为30%以上。肿瘤细胞体积起码抵达0.2mm3。为保证FFPE标本DNA索取的胜利率，尽或许送检1年之内的蜡块或6周之内的白腊切片，切片厚度4～5μm；手术模范（大模范）：≥5张；穿刺模范（小模范）：≥10张。若结构模范中肿瘤细胞含量较低，仍需举行NGS探测的话，应只管采取显微切割手艺富集肿瘤细胞，并在汇报中提醒模范控制性）[1],[6]。
处置办法：必须在结构离体后30min内浸入适当结构不乱液中举行不乱（液体与结构巨细比例为10:1），避让运用酸性及含有重金属离子的不乱液。大标本应切开后充足不乱至6-48h，不超出72h。小活检标本可不乱6-12h[1],[3]。
评估办法：制做白腊切片刻，切取5片不断切片，此中1片举行HE染色评估肿瘤细胞的含量[1]。
图3FFPE模范切片示企图
3
血浆或血液模范
搜罗请求：cfDNA是存在于血浆中的游离DNA，肿瘤滥觞的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中出入迥异。运用EDTA抗凝真空采血管，搜罗5-10ml外周血索取血浆游离DNA举行探测[1],[6]。
处置办法：运用EDTA抗凝真空采血管，搜罗5-10ml全血，4h内分别血浆，索取游离DNA，保管于-80℃冰箱中，并避让屡屡冻融[1]。如外周血需永劫间输送，提议用商品化游离DNA模范专用保管管，如SterckBCT管，在常温前提下，可不乱保管长达14天。
4
细胞学模范
①零落细胞学标本及细针穿刺细胞学标本用于基因探测时，必然举行病理质控，肯定标本中的肿瘤细胞数目及与寻常细胞的比例。契合品质请求或过程肿瘤细胞富集处置后契合请求的标本可直接抽提核酸，也能够制备成FFPE细胞学蜡块举行后续解析。
②肿瘤科医生在请求胸水标本的基因探测时，必然同时举行液基细胞学探测来举行病理评估残余液体冷藏/冷冻保管。体腔积液标本可索取无细胞上清标本中的轮回肿瘤DNA（ctDNA）举行探测[1],[3]。
用于渐变基因探测时，离心后获得的细胞块模范的保管办法与结构样真不异[6]。
模范保管与处置
肿瘤私人化调节基因探测汇报发出后的残余模范应尽或许较永久保管。熟练室应拟订模范储蓄轨制对模范举行保管，树立模范储蓄的规定轨制，做好模范的标帜并按划定寄放，保管好模范的原始标码，树立配套的模范寄放消息治理系统。模范的处置和关连材料的处置要契合《调理废料治理规则》、《调理卫希望构调理废料治理想法》及国度、地域的关连请求[6-7]。
图4用于保管模范的-80℃冷冻冰箱示企图
关于大型机构来讲，生物物模范库是模范保管、紧急科研成绩加紧财产化、成绩运用莅临床及完结“变化医学”的紧急保证。生物模范库主借使指准则化搜罗、处置、储蓄和运用生物体（衰弱/疾病）的细胞、结构、血液、器官等模范，以及与这些生物样真关连的临床、病理、调节、随访、知情允许等材料及其品质遏制、消息治理与运用的系统。
主动化模范库关连于保守生物模范库形式（人为+冰箱）来讲，具备节能、储备消息的确、平安高效、消息化等上风。其在支持精确调理、全民大衰弱、新式农业、物种各种性、海洋水产、微生物协商等范畴表现的效用阻挡小觑。
归纳：
模范猎取后品质的评估对后续终归的解读有紧急意义，临床模范的采样历程、解析前的输送和处置以及病理的评估终归等均应做响应的纪录。品质评估的实质应囊括肿瘤细胞含量比例、肿瘤细胞的数目，是不是遵循请求举行处置与输送等。评估办法囊括肉眼窥察、显微镜下窥察等。关于肿瘤细胞散布齐集的地域应举行标注，需求时举行显微切割后再索取核酸[1]。
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参考文件
[1]华夏临床肿瘤学会非小细胞肺癌大师委员会.二代测序手艺在NSCLC中的临床运用华夏大师共鸣(版)[J].华夏肺癌杂志,(9).
[2]BensonAB3rd,VenookAP,Bekaii?SaabT,etal．Rectalcancer,version2．［J］．JNatlComprCancNetw,,13(6):?．
[3]王恩华,朱明华,步宏,等.非小细胞肺癌靶向药物调节关连基因探测的楷模提议[J].中华病理学杂志,,45():73-77.
[4]《基于下一代测序手艺的BRCA基因探测过程华夏大师共鸣》编写组.基于下一代测序手艺的BRCA基因探测过程华夏大师共鸣[J].中华病理学杂志,,():-.
[5]国度卫生和商量生养委员会.肿瘤私人化调节探测手艺指南（试行）.年10月2日
[6]李金明.高通量测序手艺[M].北京:科学出书社,
[7]中华群众共和国卫生部.调理卫希望构调理废除物治理想法[S]..
泛生子（纳斯达克代码：GTH）是寰球前沿的癌症精确调理公司，埋头癌症基因组学的协商和运用，供给癌症初期筛查、用药疏导、预后监测、肿瘤新药研发效劳等遮蔽癌症全周期的产物与效劳，力求于将革新基因组学手艺，运用于与癌症关连的诊断、调节，最后征服癌症。
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