大家好！今天为大家介绍一篇年5月发表在Naturebiotechnology的文章，题目为“DeepVisualProteomicsdefinessingle-cellidentityandheterogeneity”。本文主要介绍了深度可视蛋白质组学（DeepVisualProteomics,DVP）技术，该技术通过结合人工智能驱动的单细胞/单细胞核表型图像分析和超高灵敏质谱，在保留空间信息的同时，建立蛋白质丰度与细胞或亚细胞的复杂表型关联性。基于此，解析出新生瘤组织中正常细胞在转变为侵袭性癌细胞的过程中蛋白质组的空间表达变化。本文通讯作者包括哥本哈根大学的AndreasMund教授、赫尔辛基大学、芬兰分子医学研究所的PeterHorvath教授、以及哥本哈根大学、德国马丁斯里德马克斯-普朗克生物化学研究所的MatthiasMann教授。
背景介绍
蛋白质是人类生命活动的主要承担者，蛋白质在不同组织，不同细胞间的异质性与癌症等疾病的产生和发展存在着密切的联系。因此，在单细胞水平解析临床样本中空间蛋白质组学有助于揭示疾病的发生机制，寻找到新的治疗靶点。显微成像技术因多功能性、高分辨率和多模态等特点，能为细胞异质性和组织结构的成像够提供众多信息。目前，蛋白成像研究仍然是靶向预先定义好的感兴趣蛋白子集进行，不足以体现实际样本中蛋白质组的复杂程度。基于质谱的蛋白组学能够显著提高蛋白分析的灵敏度。本文发展了一种深度视觉蛋白质组学（DeepVisualProteomics，DVP）技术，将亚微米高分辨率显微镜、机器学习和超高灵敏度质谱蛋白质组学结合，解析在空间背景下，蛋白质丰度与细胞或亚细胞复杂表型之间的联系。
设计思路
DVP技术是通过发展基于深度学习的细胞分割算法和基于机器学习的细胞类型/状态鉴定技术，将高分辨率细胞或组织图像进行分析，例如培养的细胞、福尔马林固定与石蜡包埋保存（FFPE）组织。进一步，基于人工智能或指令指导下，对细胞或亚细胞区域样本选取后进行激光显微切割（LaserMicrodissection，LMD）。随后，利用质谱进行蛋白组分析（图1）。通过数据分析，揭示蛋白质组的特征，从而在保留完整空间信息的基础上，为细胞表型间的蛋白质组变化提供更高维度的分析。
图1.DVP的定义与工作流程
数据介绍
（1）图像指导的单细胞分离技术用于细胞类型解析的蛋白质组学
首先，作者用扫描显微镜对样本全片获取高分辨图像，并开发了一套图像综合分析软件BIAS（BiologyImageAnalysisSoftware,BIAS)。BIAS拥有图像前处理，基于深度学习的细胞分割、细胞形态特征提取和基于机器学习的细胞类型鉴定等功能，能够读取2D、3D等图片（图2a）。作者将BIAS与其他生信算法对比，作者训练得到的算法在对组织或者培养的细胞和细胞核进行切割时的准确率最高（图2b）。同时，BIAS作为扫描显微镜与LMD显微镜之间的衔接，可以优化切割路径（图2c），切除时利用轮廓线进行补偿以防止激光对细胞膜的潜在伤害（图2d）。
为了验证DVP技术的灵敏性、特异性和稳定性，作者利用纤毛细胞特异的转录因子FOXJ1的抗体和上皮细胞特征蛋白EpCAM的抗体对来自正常人的输卵管上皮组织中这两种主要细胞类型进行免疫荧光检测，并且进行蛋白质组学检测（图2e-h）。符合预期地，作者只在FOXJ1阳性的细胞中检测到了FOXJ1转录因子（纤毛细胞），蛋白组数据包括超过种蛋白质表达水平（图2e，g），且蛋白质丰度的差别很好地体现了不同细胞类型的生物学特征（图2f-h)。
图2.BIAS综合图像分析和自动LMD单细胞分离（2）DVP在亚细胞水平上定义单细胞异质性
为了验证DVP是否能对表面蛋白组相似的（基于荧光泛素化的细胞周期标记，FUCCI）U2OS细胞进行功能异质性的表征。利用BIAS针对每个细胞表型分离了80-个单细胞或-个细胞核（图2c，d；图3a，b）。通过无监督分析模型（图3d），基于细胞核区域、周长、形状系数、紧实度和核染强度分离出6种大小和形状特异的细胞核（图3e，f）。第1组有丝分裂阶段细胞，其余5组为不同形态的处于细胞间期的细胞（图3e，f）。蛋白质组的差异分析显示这五组细胞核差异表达的蛋白主要与细胞核和细胞周期相关（图3h-j）。第6组细胞核在蛋白组表达水平上与已知的细胞周期标记蛋白差异显著（图3i，j），其中特异表达的蛋白包括上调的细胞骨架、细胞粘附相关的蛋白，表明了该组属于细胞核正在变形的迁移细胞。这些结果表明，无论是常见表型或者是罕见表型，DVP可以无偏倚地将细胞异质性与动态蛋白质水平联系起来。
图3.DVP在亚细胞水平上定义单细胞异质性（3）DVP应用于肿瘤组织的异质性研究
对癌症病人的石蜡包埋组织进行亚细胞水平的空间蛋白组学研究，具有巨大的临床意义。作者选择了罕见的唾液腺上皮分泌细胞恶性肿瘤的石蜡包埋组织进行DVP分析。首先从正常腮腺组织中根据细胞特征分离出腺泡细胞和导管细胞，并对LMD后的单细胞进行蛋白组质谱测定（图4c），蛋白组结果显示了两种正常细胞特异的生理学特征。作者进一步在同一片组织不同区域单独提取了癌细胞和良性腺泡细胞进行比较，不同癌症阶段的腺泡细胞蛋白组的成功聚类说明了细胞来源性强关联。而正常细胞与癌细胞间则体现了较低的相关性（图4d，e），表明了正常细胞与癌细胞间的显著的蛋白表达差异。作者还发现干扰素反应蛋白和原癌基因SRC在癌细胞中的上调（图4e），并通过IHC对发现的上调基因做组织层面的验证，从而证明了DVP方法的准确性。
图4.DVP应用于一种罕见的涎腺癌的石蜡组织
最后，作者对原生黑色素瘤组织的不同细胞表型进行DVP分析以研究癌症发展。首先，作者从同一组织切片的七个区域分离并分析27个样本，每个样本约个细胞（图5a-d)。作者发现从黑色素细胞、癌前黑色素瘤到侵袭性黑色素瘤，参与氧化磷酸化和线粒体功能的蛋白表达逐渐增加，表明在晚期肿瘤阶段细胞对线粒体呼吸的依赖（图5h-j)。相反地，黑色素瘤细胞与癌前黑色素瘤细胞相比，抗原呈现、干扰素反应和免疫逃逸等相关蛋白下调（图5h-j）。作者还发现了癌症纵向侵染过程中显著增加的mRNA剪切，而这增加的mRNA剪切又与显著下降的免疫相关信号转导（干扰素反应和抗原呈现）相吻合（图5l)，表明在同一肿瘤区域的垂直侵袭阶段中，细胞的免疫原性从“热”到“冷”的变化。总的来说，DVP通过在不同组织区域定位肿瘤相关的mRNA剪切，免疫反应和细胞外基质重塑通路，在空间上解析出了肿瘤异质性。
图5.DVP应用于原发黑色素瘤组织
总结
本工作基于成像蛋白质组学的DVP技术，可量化特定细胞中的表达蛋白质，并绘制特定细胞类型或组织的蛋白质组图。DVP可展现组织中丰富的微观世界，发现在肿瘤发展过程中失调的重要通路。该技术能够广泛应用于任何能够显微成像的生物体系，发现并表征罕见细胞状态和胞间相互作用。与单细胞转录组相比，DVP已经能够分析胞外基质的亚细胞结构和空间动态，随着蛋白组学技术的发展，DVP有望应用于单细胞水平的蛋白质变体和翻译后修饰研究。
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