谨以此文，纪念那些年我做过的Westernblot。
——一位不愿透露姓名的科研民工
提起Westernblot(WB)，很多人都能哭诉半宿。
这是一个基础实验，也是一个让大家头疼的实验，简称“玄学”。
话不多说，做过的都懂。
今天给大家提供WB最全避雷手册，希望大家能愉快实验，顺顺利利。
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倾尽全力，长文预警
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？
答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新进口的显色底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a)二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；
b)ECM底物中本身含双氧水，不稳定，见光或温度高时易失活；现配现用。
c)ECL底物没覆盖到相应位置；
d)二抗时间过期，或平时使用不当导致二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
答：a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作，看是否有改善.；
b)显影时间过长，一般3-5分钟就够了，特殊情况需摸索显色时间。
10、DAB好还是ECM好？
答：DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到检测的阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况，目前大家一般使用ECM。
11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？
答：a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。
b)蛋白本身有修饰如糖基化、磷酸化等均会增大蛋白分子量。
12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker转上去了，为什么？
答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够。(注意！Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准，它只是为我们提供简单的指示作用。)
13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。
14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和WB试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：a)免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；WB可以特异性检测某个蛋白质分子，如抗体选择合适，灵敏度很高。WB进行定量，但是不能定位。
b)两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丢失较少。
20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以减少电流延长时间，加20％甲醇；还有一种办法就是采用最新的WES来检测，灵敏度极高，但价格贵。
21、想分离的蛋白是分子量kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WB吗？
答：kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶3.5％。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间，但必须控制温度，保证低温电泳和电转。
26、一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：WB一般上样30-μg不等，结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行，或者抗体效价低则注定事倍功半。
27、做组织样品的WB的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温)，蛋白质溶解度会更好，离心要充分(10转/min，10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
28、大分子量蛋白KD或以上，在做WB要注意什么呢？
答：做KD蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择7%的；胶很软，剥胶时要小心；转移时间需要相应延长(至少mA，3h或以上)；必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。
36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？
答：肯定可以，建议先检查非磷酸化蛋白，然后使用抗体洗脱液将抗体洗去，再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。
37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？
答：这是正常的，大分子的蛋白转移很慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点：丽春红染色较好，不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准，这是两个概念，；丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。
51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
52、怎样才能跑出漂亮的胶，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？
答：影响跑胶跑的质量，提供2个小建议：
a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V，分离胶75V就能跑得很好，但是实验的时间会很长。
b)胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀(不要有气泡)，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶。
56、WB结果中杂带较多
可能的原因及建议：
①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等)，本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小，这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。
②目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。
③样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂；样本处理在冰上操作。
④上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。
⑤一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。
⑥一抗不纯，纯化抗体。
⑦一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度。
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