提要
免疫结构化学探测是病理科不行或缺的探测技能之一，其标准化和准则化波及一切免疫结构化学探测的全过程，包罗结构处置、探测次序、成绩判读、品质遏制等各个次序。促进免疫结构化学探测标准化、准则化和可溯源性，升高和削减数次、人员、病院、地域间探测成绩的不同性，提升无误性，为临床病理诊断、无误医治和预后评估供应紧要根据。
正文
免疫结构化学是在结构切片或细胞涂片上，行使抗体探测抗原并将其可视化的技能。在脾气化的精确疗养时期，免疫结构化学技能要紧用于病理诊断、鉴识诊断、判定疾病的预后和评估临床疗效、对分子靶标举行定位指点医治以及对未分裂和异质性的肿瘤举行研讨，曾经成为病理诊断中不行或缺的技能手法，其成绩的无误性和可反复性需求一切探测体制的品质遏制。当前免疫结构化学探测技能在地域、病院、科室和人员之间存在较大不同，由于缺乏标准，在本质职掌历程中存在很多题目。为此免疫结构化学探测准则化、标准化和可溯源性势在必行。强调品质遏制波及结构处置、探测中间过程及成绩判读等各个次序。
一、免疫结构化学探测的结构处置
国内发布的各项临床指南/老手共鸣中都波及对结构处置的请求，技能人员应准时知道并遏制最新进取，并根据国内关系探测指南的革新举行调度。
（一）结构稳固
稳固的意义是保管结构细胞的抗原性，使抗原物资不产生弥漫和抗原性耗费[1]。越来越多的研讨及尝试数据讲明，克制则的结构稳固是致使免疫结构化学成绩克制确的要紧要素。
惯例稳固必要操纵3.7%中性缓冲甲醛（pH7.2~7.4）。结构离体后应尽或许在30~60min内开端稳固[2,3]。推迟稳固引发的蛋白质降解可致使靠山非奇异性着色增进，衰弱免疫结构化学的染色强度[4-7]。
稳固不匀称将会致使免疫反映的异质性；而稳固过分（固按时候72h）或稳固不够（固按时候6h）会致使免疫反映性升高或彻底耗费、搅扰免疫活性。准则前提为结构标准剖开后置于不少于本身材积4~10倍的中性缓冲甲醛稳固液中，根据结构巨细，固按时候为6~48h[2-3]，关于活检小结构固按时候亦不该少于6h。稳固不够是当前病理科应高度看重的题目。
（二）脱钙-结构稳固后处置
脱钙剂有或许形成抗原耗费，抗原修理也无奈复原耗费的抗原，无奈保证免疫结构化学探测的牢固性。创议脱钙结构的免疫结构化学探测汇报应讲授结构过程脱钙处置和操纵的脱钙法子。
（三）结构脱水、通明、浸蜡
结构处置历程包罗脱水、通明和浸蜡三个阶段。科室需根据本质环境，过程严酷的测试，拟定准则化的结构脱水、通明、浸蜡过程及试剂改换程序。
创议操纵主动结构脱水机和梯度乙醇脱水计划，如70%乙醇?85%乙醇?95%乙醇×2?无水乙醇，根据处置结构的类别和巨细以及脱水机的处事效率，每种梯度乙醇的做历时候可设定为60~min。脱水时候不够会致使后续染色成果欠安。二甲苯做为结构通明剂精深操纵在结构处置次序，创议操纵两道通明剂，每道时候约15~60min。未准时改换试剂易形成结构处置不良。
逐日必要监控结构脱水机中的白腊温度和缸内的白腊体积，屡屡改换和增进白腊。浸蜡需过程2~3次浸蜡程序，屡屡时候为30~90min不等。在结构处置的任何历程中，标本干枯结构形状和抗原会遭到伤害。
妥当的结构处置是获取优良免疫结构化学制片的前提，结构处置应严酷根据科室关系准则化职掌程序（SOP）文件的请求举行。
（四）结构包埋
结构平放于包埋模具中，根据结构的类别决意包埋方位。
（五）结构切片
免疫结构化学应操纵防脱玻片，切片厚度为3~5μm，切片过薄会致使抗原缩小进而抗体阳性表白衰弱，切片太厚极易在抗原修理中脱片且影响视察。保证白腊切片与载玻片间无气泡，若有气泡或许会致使局灶性非奇异性染色。推举烤片温度高于白腊熔点2~3℃，60~min，忌高温永劫间烤片。
免疫结构化学探测应只管操纵新鲜切片（1周之内的切片视为新鲜切片）[8]。切片最幸而2周内举行免疫结构化学探测，如2周后探测，有尝试室推举将切片密封后放入冰箱冷藏，并于1个月内达成关系探测。白腊切片悠久安放后免疫稳固性的耗费会致使染色强度升高、阳性细胞的数目缩小。有文件报导超出20年的蜡块举行免疫结构化学探测时亦视察到此局势[8,9]，而且这些影响在存档5年后的蜡块RNA水准探测中也会视察到。
二、免疫结构化学探测次序
（一）前处置：脱蜡和抗原修理
每每操纵二甲苯脱蜡，浸泡3次，屡屡3min。梯度乙醇的递次为%×2、95%×2、70%×2，每种梯度乙醇中浸泡1~3min。脱蜡不够是免疫结构化学染色失利的最罕见起因。脱蜡用二甲苯必要屡屡改换，防备脱蜡不彻底致使的染色失利，并可根据本质环境伸长脱蜡时候，脱蜡液的改换时候及方法应注册在免疫结构化学常日质控注册表中。可操纵水性脱蜡剂和水化试剂[10]，其具备脱蜡、水化和抗原修理"三合一"成效，能够加热，使历时应严酷参照解释书中脱蜡片数和次数的规则。
罕用的抗原修理法子有酶消化法和热修理法。酶消化由于蛋白水解会摧残结构形状，因而需筛选性操纵，严酷遏制浓度和做历时候。而热修理最罕用的修理液为pH6~10之间的柠檬酸盐溶液和乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。加热的法子有水浴、高压、微波或高压蒸汽，要紧推举高压和水浴修理方法。根据加热法子不同，接续时候2~30min不等，加热时候可优化调度。遏制无误的温度和时候是到达最好抗原修理的关键，也是获取最好且稳固的染色成绩的关键。克制操纵家用微波炉举行抗原修理处置。可根据抗体解释书筛选适当的抗原修理方法，抗原修理的法子、修理液的配制及改换、修理液的pH值及详细修理前提等，均应准时注册在免疫结构化学常日质控表中。
（二）封锁
封锁是免疫结构化学探测中处置非奇异性搅扰的罕用法子。
1．封锁非奇异性着色：
非奇异性着色每每是匀称的，可过程滴加与二抗种属同源的被稀释后的非免疫性血清升高靠山。
2．封锁内源性过氧化物酶：
很多结构中存在内源性过氧化物酶，可过程与底物3,3′-二氨基联苯胺（DAB）贯串而着色。在一抗孵育前，过程3%H2O2灭活内源性过氧化物酶活性。部份结构还含有内源性碱性磷酸酶（AP），可采用左旋咪唑预处置举行灭活。
3．封锁内源性生物素：
生物素存在于各式结构中。操纵生物素记号的探测系统，链霉蛋白素会与内源性生物素贯串形成靠山染色。冷冻结构内内源性生物素含量更高，能够用未记号的蛋白素举行处置，每每可采用新鲜的蛋清溶液。
（三）一抗的运用
1．新抗体的免疫结构化学评估：
新抗体在用于诊断前，必要探求其最好反映前提。不同厂家临盆的克隆号雷同的抗体其效价也不尽雷同，必要在操纵行举行考证，到达预期成绩方可用于临床探测。新抗体购入科室后，应立刻举行试剂验收，其体例包罗：抗体称号、克隆号、抗体种属、剂型、规格、临盆批号和灵验期等消息。并在最短时候内对到货的抗体举行考证，体例包罗：抗体效价、阳性结构、阴性结构、染色定位等。关于统暂时候送货的同批次同种试剂可筛选此中一支举行考证，而关于非统暂时候送货的同批号试剂创议再次考证。经尝试室考证及格后方可举行关系抗体消息的注册入库，并用于临床诊断。入库抗体应根据解释书中供应的方法举行储存，-20℃储存的抗体假设需求屡次操纵，须举行分装，以防屡次冻融升高抗体效价。
2．抗体效价：
在免疫结构化学探测中获取最好染色时所用抗体的最大稀释度即为抗体效价。所谓最好染色即阳性最强、靠山最小、反差成果最好。最好染色时染色强度应具备不同，而非细胞着色朦胧一片、强弱不分。由于肿瘤结构中蛋白表白不均一，因而在预尝试中需求采选多种肿瘤结构多种抗体浓度无误评估蛋白的表白。
关于浓缩型抗体每个新批次均需举行"滴定"实验。假设操纵的二抗为已注册的免疫结构化学试剂，一抗只要简略滴定测试便可。抗体梯度测试局限从推举稀释度的高于2倍至低于2倍之间肯定最好抗体稀释度。体外诊断试剂的即用型一抗和探测系统，则不需求再举行"棋盘滴定"测试。
3．抗体稀释液：
抗体稀释液为增加蛋白稳固剂的缓冲液（譬喻PBS和Tris），利于稳固和维持抗体的免疫活性。坚固型稀释液能够同意更高的稀释倍数，缩小靠山染色。
4．抗体孵育时候和温度：
根据产品解释书要乞降结构切片的前处置环境肯定抗体的孵育时候和温度，可针对不同环境举行调度。应防备永劫间的高温孵育，防备干片或形状伤害。
罕用的一抗孵育时候和温度，室温：30~min；4℃：留宿；37℃：30~60min。孵育时载玻片应置于湿盒封锁空间内，防备抗体挥发。
5．即用型抗体：
在贩卖前即根据用处特地配制，其浓度和探测过程均被优化，保证试剂功用和不同批次间的稳固性，不需求操纵者从新调度。
（四）二抗和探测系统
体外诊断即用型探测系统保证完成绩的一致性，尝试室可根据本身环境采用不同的探测试剂盒或抗体。体外诊断试剂在其产品解释书中会供应优化了的探测过程、产品功用特点和灵验期等消息，其二抗孵育时候和温度以解释书为准。
1．显色：
根据所记号酶的不同筛选不同的显色剂，最后产品的颜色亦不同。屡次的显色会2倍、3倍强调染色成绩。辣根过氧化物酶的罕用显色剂为DAB或3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）。DAB显色为褐色产品，AEC显色为醇溶性红褐色产品。罕用DAB显色时候为室温5~10min。AP罕用的显色剂是5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（BCIP/NBT）、氯化四氮邻二甲氧基苯胺（Fastblue）和1,5-苯二磺酸盐（Fastred），产品溶于乙醇，需求操纵水溶性封片剂。
2．比较染色：
最好的比较染色颜色与显色成绩有猛烈反差，且不搅扰视察较弱的染色成绩。比较染色时还需思考封片剂的影响，譬喻AEC溶于乙醇和二甲苯需求筛选操纵水溶性封片剂。
（五）脱水通明、封片、归档
染色后结构切片过程梯度乙醇-二甲苯脱水通明处置，永远封片（如DAB显色）。AEC显色不能按永远性封片归档。
一切尝试室应该根据准则请求保管和处置病理模范和试剂耗材。年3月6日原卫生部办公厅印发《病理科建造与办理指南（试行）》的第三章第十八条文则：病理切片、蜡块和阳性涂片保管克日为15年。切片应该保管在干枯处境下，防备温渡太高。结构包埋蜡块应该积聚在有温控的处境中，创议在储存前对其举行封蜡处置。
（六）主动染色
如今有半主动或全主动的免疫结构化学染色机可供筛选。每每来说，一台调养优越和校准无误的主动染色机能够优于或同等于手工染色。全主动染色仪的运用将会促进批次间及白天染色过程的准则化，提升染色的一致性及反复性，是进取的必要趋向。
三、免疫结构化学成绩的基本判读规则
免疫结构化学成绩的视察及判读均需求必要的靠山学识和业余阅历。技能人员必要遏制基本判读规则、罕见抗体阳性部位及阳性表白，利于免疫结构化学质控处事的举行。
（一）染色成绩的判读
免疫结构化学的成绩判读因而视察染色形式为基本，将视察成绩与预期成绩举行比对得出的论断。大都染色成绩的判读为定性，即阳性（+）或阴性（-）。在某些非常环境下，如对肿瘤结构中激素受体蛋白、靶向医治的靶标蛋白、细胞增殖蛋白等举行免疫结构化学探测时，染色成绩多采取半定量计数法[11]，通常是染色强度与阳性细胞比例相贯串举行判读。个体分子靶向蛋白染色成绩也会示意为阳性（+）或阴性（-），如间变性淋巴瘤激酶（ALK，克隆号DF53，Ventana探测平台）的探测。
多数部份抗原表白部位不同，所代表的诊断意义不同，如p在乳腺小叶癌与导管癌中表白部位不同。
（二）评估免疫结构化学探测成绩的准则及圈套
1．评估免疫结构化学探测胜利的准则：
阳性及阴性比较能够保证尝试成绩的可托性。采用已知阳性或阴性的结构或细胞系做为阳性及阴性比较，与待测结构同时举行雷同的染色，并过程较量举行成绩判读。任何比较结构染色成绩与预期不符时，必要找寻起因后从头染色。（1）阳性内比较：除了在尝试中设立阳性或阴性比较外，视察尝试切片中本身阳性内比较是特别紧要的[12]，譬喻在细胞角蛋白染色中，视察肿瘤中残剩的寻常上皮细胞是不是阳性。（2）染色部位不无误则视为假阳性：譬喻膜抗原（如CD20、HER2等）阳性记号涌如今胞质或胞核时，应视为假阳性[13]。跟着对免疫抗原亚细胞定位的更深入研讨，免疫反映的形状也是紧要参考根据，如嗜铬素粒A、T细胞胞质内抗原等的染色应呈胞质内的颗粒状，如呈胞质匀称一致的染色成果，则染色成绩不行靠。
2．免疫结构化学成绩中的重视事情：
寻常结构抗原表白招思考到人体发育、生理学及寻常的转变。譬喻：雌激素受体（ER）及孕激素受体（PR）表白随月信周期所处的天数而形成转变。生理的或许探测前（解析前）要素还会影响抗原在细胞的定位。同种抗体的克隆号不同，表白也或许存在不同。Ki-67为核表白，而在脂肪细胞、细支气管肺泡壁Ki-67（克隆号MIB-1）可呈膜性表白。
四、免疫结构化学品质遏制
免疫结构化学的品质遏制贯串于病理科免疫结构化学尝试的全过程，其包罗室内质控和室间质控。免疫结构化学探测过程中任何一个次序的调度及试剂的改换均应纪录在案，有据可查。
（一）室内质控
1．比较结构的配置：
配置阳性比较和阴性比较是考证职掌次序是不是无误及染色成绩是不是无误的关键，根据比较染色成绩能够判定职掌的无误性和试剂的灵验性。志向环境是将一个已知的阳性比较和患者的探测模范置于统一张切片上，保证一切试剂同时与患者模范和阳性比较反映，最大限度地保证两者探测前提的一致性。为保证抗原活性，阳性比较片现用现切，不行永劫间保管。关于与肿瘤靶向药物医治关系的探测项目[譬喻HER2、ER、PR、ALK、CD20、CD和程序性逝世分子配体1（PD-L1）等]，必要配置比较。其比较的设立应根据国内探测指南/老手共鸣配置，关于无指南/老手共鸣的抗体应设立阴性及阳性比较，以保证成绩的牢固性。
（1）阳性比较：操纵已被解释含有靶抗原成份的结构做为外部阳性比较。假设阳性比较无阳性染色或染色强度转变，同批次的探测模范染色成绩失效。每批次探测都要有阳性比较。外部阳性比较结构应筛选有特点性低水准阳性表白的探测模范。操纵低表白的外部阳性比较能够明白由于探测体制的微小转变而致使的免疫结构化学染色不稳固，强阳性比较或许致使弱阳性表白的结构涌现假阴性成绩。操纵强表白的肿瘤或许致使校准尝试成绩克制确。细胞系亦可用于尝试比较。最志向的比较配置中应包罗不同水准表白（强、中、弱）及阴性表白的结构，以保证一切探测体制的无误性。优先筛选表白抗原的寻常结构做为阳性比较。某些抗原在寻常结构中很少表白，或在寻常结构中布满性表白（黑色素细胞和卵巢细胞），或寻常结构类别难以获取表白，关于这些环境，能够操纵已被证明阳性表白的肿瘤结构用做外部比较。年国际特设老手委员会推举18种病理诊断罕用抗体比较结构及染色成绩的判读准则[14]。各单元能够根据本单元环境肯定本人的免疫结构化学阳性比较结构。已知的阳性比较结构是为了结构处置历程和尝试试剂灵验性的质控，不能做为患者模范奇异性诊断的准则。假设已知的阳性比较染色失利，则模范探测失效。
（2）阴性比较：包罗奇异性和非奇异性阴性比较2类。奇异性阴性比较包罗阴性试剂和阴性结构比较。临床上较为罕用的是奇异性阴性结构比较。阴性比较无奇异性表白解释无交错反映涌现。假设奇异性着色（假阳性）涌如今阴性比较结构中，患者模范探测成绩认定为失效。阴性试剂比较尝试包罗除了奇异性一抗之外的一切历程（如抗原修理、封锁、孵育及探测系统）。志向的替换试剂是含有除奇异性一抗外的一切另外成份，且与一抗临盆历程雷同，对人体结构不形成奇异性反映。孵育时候与一抗一致。待检结构中染色强度的视察应在阴性试剂比较不过奇异性染色的环境下评估。阴性成绩象征着未探测到抗原，而非细胞或结构中不存在该抗原。
（3）结构内比较：最好阳性内比较是待检模范中特点性表白靶抗原的寻常细胞，其与待检结构具备雷同的前处置前提。不是一切的记号都具备适合的或可获取的结构内比较。寻常结构抗原的表白会因生理转变而产生转变，进而束缚筛选其做为内比较。结构内比较如涌现假阳性染色或假阴性染色均讲明尝试失利。
2．仪器配置质控：
病院开端运用全主动/半主动免疫结构化学仪举行免疫结构化学探测，响应的仪器配置应归入质控局限。配置波及的一切要素（试剂、仪器维持等）均应质控，并纪录关系体例。
（二）室间质控
按期参与室间质控是保证明验室探测无误性的紧要手法之一。尝试室能够根据本单元本质环境按期参与不同的室间质控。
本共鸣从结构处置、探测次序及重视事情、成绩判读、品质遏制等对免疫结构化学探测全过程举行了系统描绘。从本质启程，死力简略，具备可职掌性、指点性和前瞻性，为促进免疫结构化学探测的准则化、标准化历程奠基基本。
益处摩擦 一切做家均申明不存在益处摩擦
（参考文件略）
《免疫结构化学探测技能共鸣》
编写构成员（以单元拼音递次摆列）
北京大学医学部病理学系（张波、张燕）
病院病理科（林冬梅、周立新）
华夏医学科学院北京协病院病理科（陈杰、李星奇、庞钧译）
北京中杉金桥生物技能有限公司（潘越宁）
病院病理科（宋欣、石怀银）
病院第七医学中芥蒂理科（田玉旺）
都门医科病院病理科（王伟）
都门医科大病院病理科（高颖）
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