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样本准备
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制备:
建议用新鲜组织否则组织细胞内部结构破坏易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等防止裂片和脱片。
将样本放入包埋盒加入OCT进行速冻
-20℃速冻
组织样本包埋底模世泰-
在OCT包埋前也可以固定组织后，使用蔗糖溶液梯度脱水。
待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上；
粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片
放下抗卷板，开始切片，切片厚度，视组织不同而不同，切出的片子用载玻片贴附晾干（5min）以防切片在后续的洗涤中脱落。
速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
2
固定
用4%PFA溶液浸泡组织切片。
室温下固定细胞60-分钟。
吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟
3
封闭
将样品在封闭液中封闭30分钟。
封闭缓冲液（1xPBS/5%normalserum/0.3%Triton?X-）：配制10ml，0.5mL正常血清（来源与二抗相同，例如正常山羊血清，正常驴血清）和0.5mL20xPBS兑到9mL蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入30μLTritonX-(%)。
TritonX-比较粘稠，可以先配制成母液，再按比例添加到封闭液中。封闭液的其他配方是10%normalserum或5%BSA，供选择4
一抗孵育
吸去封闭液，加入稀释的一抗（50μL）。
在4°C孵育过夜。吸弃一抗，用PBS润洗3次，每次5分钟。
抗体稀释缓冲液（1xPBS/1%BSA/0.3%TritoX-）：配制10mL时，取30μLTritonX加入到10mL1XPBS中，混匀后加入0.1gBSA(#)，混匀至全部溶解。也可以直接用封闭液配制抗体。
封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液
把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的，将样品与稀释抗体在室温下避光孵育1小时。吸弃二抗，用PBS润洗3次，每次5分钟。
注意：在做双染时，将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液
5
封片
抗荧光淬灭封片液封片。
6
拍照
立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。
如果要长期保存，将玻片放在4°C避光保存
今天的科研笔记就到这里，大家有没有收获或者疑问呢，或者实验当中的一些小tips，可以评论区留言哦,我们下期再见！
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