纲要：宗旨树立溃疡性结肠炎关联结肠癌（UCRCC）与NF-κB记号通路的网络模子，猜测UCRCC的关键炎性靶标，明白葛根芩连汤及其目标成份组合物对这些靶方向影响。法子采取HPLC法，固定相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱，测定10种目标成份；检索Pubmed、ScienceDirect等数据库，别离查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的高低游卵白，采取Cytoscape软件，猜测UCRCC的关键炎性靶标；在AOM/DSS引诱的UCRCC小鼠模子中，经历免疫组化、ELISA法子明白葛根芩连汤及其目标成份组合物对关键炎性靶方向影响。成效葛根芩连汤中葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的含量别离为1.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.μg/g。交互网络中归纳排名较高的前8位炎症因子别离是NF-κBp65、iNOS、COX-2、Bcl-2、TNF-α、IL-1β、ICAM-1和VCAM-1。与模子组对比，葛根芩连汤低、中、高剂量组及其目标成份组合物组、美沙拉秦肠溶片（5-ASA）组均显著下调UCRCC模子小鼠结肠机关中NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2卵白抒发（P＜0.01），并显著消沉血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1程度（P＜0.05、0.01）。论断葛根芩连汤及其目标成份组合物可以改观UCRCC小鼠结肠机关病理处境，并下调炎性因子的抒发，对UCRCC具备必要的干扰影响，为断定葛根芩连汤原料标识物（Q-marker）奠基了根基。
做为响应中药平安性和有用性的原料管制新形式，基于刘昌孝院士提议“中药原料标识物（Q-marker）”的新观点[1-4]，国表里学者对元胡止痛滴丸、脑心通胶囊、双黄连制剂等施行了大批寻求[5-9]。Q-marker是与中药的机能属性亲密关联的化学物资，“有用性”是该研讨形式中的关键成分之一。
葛根芩连汤具备轻清解肌、清热止利的工效，用于诊疗太阳表邪内陷而至肠热下利证，当代药理学研讨表明葛根芩连汤及其药效物资在解热、镇痛、抗炎、免疫、止泻、抗菌等方面均有精良的影响[10-12]。溃疡性结肠炎关联结肠癌（ulcerativecolitisrelatedcoloncancer,UCRCC）是溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）布景下多发的结肠癌，是UC患者的要紧仙逝道理[13-15]。现在，漫溢学者觉得UCRCC的病发机制与UC病程、炎症严峻程度呈正关联[16-17]。研讨表明NF-κB通路是桥连UC和UCRCC关键。同时，课题组前期曾经揭发葛根芩连汤及其药效物资紧要经历阻断NF-κB通路诊疗UC的要紧机制[18-19]，故估计葛根芩连汤也或者经历调控NF-κB通路干扰UCRCC。本熟练旨在研讨葛根芩连汤及其目标成份组合物对UCRCC的影响，而个中关键题目是怎么从漫溢目标成份中，有针对性地挑选Q-markers。
1仪器与材料
1.1仪器
Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Adventurer电子天平（美国OHAUS公司）；Cytoscape（3.6.1）软件；MULTISKANMK3全主动多机能酶标仪（美国Thermo公司）；RM病理切片机（德国徕卡公司）；DHA电热恒温造就箱（美国OHAUS公司）；Nikon颠倒显微镜及成像系统（日本尼康公司）；AnkeTDL80-2C离心思（上海安亭科学仪器厂）。
1.2药材
葛根、黄芩、黄连、炙甘草置备自哈尔滨市情外区三棵树药材墟市，经哈尔滨贸易大学杨玉山工程师审定别离为豆科植物野葛Puerarialobate(Willd.)Ohwi的干枯根、唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干枯根、毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干枯根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干枯根及根茎。
1.3方剂与试剂
葛根素（批号）、大豆苷（批号）、黄芩苷（批号）、黄芩素（批号）、汉黄芩素（批号）、盐酸小檗碱（批号）、盐酸巴马汀（批号）、盐酸药根碱（批号）、甘草酸（批号）、甘草苷（批号）对比品购于四川省维克奇生物科技有限公司，原料分数均≥98%；乙腈（色谱纯，批号）（FisherScitific公司）；氧化偶氮甲烷（AOM，批号A，美国Sigma公司）；葡聚糖硫酸钠（DSS，相对分子原料～，批号，美国MPbiomedical公司）；美沙拉秦肠溶片（5-ASA，批号H，黑龙江天宏药业股分有限公司）；ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒（北京中科万邦生物科技有限公司）；目标成份组合物由索取物按测定比例构成：葛根素、黄芩苷、盐酸小檗碱、甘草酸铵、盐酸巴马汀索取物（宝鸡市润宇生物科技有限公司）、大豆苷索取物（天津中新药业有限公司）、甘草苷索取物（富生制药有限公司）、盐酸药根碱、汉黄芩素索取物（四川省维克奇生物科技有限公司）。
1.4动物
明净级BALB/c小鼠，雌性，8周龄，体原料（20±2）g，置备自长春市亿斯熟练动物本领有限公司，答应证号SCXK--。动物喂养于室温20～25℃，相对湿度45%～70%的处境下，自在饮食饮水。
2法子与成效
2.1葛根芩连汤化学成份解析
2.1.1色谱前提AgilentC18色谱柱（mm×4.6mm，5μm），固定相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～10min，15%乙腈；10～25min，30%～40%乙腈；25～40min，40%～80%乙腈；40～50min，80%～%乙腈；50～55min，%～15%乙腈；柱温30℃；体积流量0.8mL/min；进样量10μL。在此色谱前提下，探测波长为nm时指认出10个色谱峰，如图1所示。
2.1.2对比品溶液的制备取葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、甘草苷、甘草酸对比品适当，精湛称定，别离加甲醇配制成原料浓度为1.20、1.05、1.08、1.15、1.04、0.96、0.99、1.13、0.98、1.06mg/mL的对比品溶液。
2.1.3供试品溶液的制备参照《华夏药典》年版对葛根、黄芩、黄连、炙甘草各饮片施行审定。取葛根8g、黄芩3g、黄连3g、炙甘草2g，参加10倍量水，浸泡30min。先煎葛根，水沸后煎煮20min，再和余药共煎至30min，滤过，残渣参加10倍量水，水沸后再煎20min，趁热滤过；归并两次滤液，浓缩，冷至常温，加水调度至药材原料浓度为0.1g/mL。
2.1.4阴性样本溶液的制备按供试品溶液制备法子，别离制备缺葛根、缺炙甘草、缺黄芩、缺黄连的阴性样本溶液。
2.1.5法子学考证
（1）线性相干观察：别离精湛量取对比品溶液，加甲醇稀释，摇匀，得系列搀杂对比品，进样测定各成份峰面积。以峰面积积分值为纵坐标（Y），原料浓度为横坐标（X），施行线性回归。成效见表1，各成份在原料浓度局限内线性相干精良。
（2）精湛度实验：精湛量取搀杂对比品溶液，赓续进样5次测定，纪录色谱图。成效表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值别离为0.75%、0.62%、1.10%、1.03%、1.05%、0.98%、0.67%、0.92%、1.08%、1.25%。
（3）稳固性实验：精湛量取搀杂对比品溶液，别离于0、2、4、8、12h进样，纪录色谱图。成效表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值别离为0.78%、0.98%、1.36%、1.08%、0.96%、0.88%、1.02%、1.13%、0.10%、0.85%。
（4）反复性实验：制备3份供试品溶液，进样测定，纪录色谱图。成效表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD值别离为0.95%、0.96%、1.15%、1.36%、%、1.05%、1.18%、1.65%、1.83%。
（5）加样回收率实验：精湛量取已知各成份含量的样本3份，每份1mL，精湛参加对比品，制备供试品溶液，进样测定，并谋略回收率。成效表明，葛根素、大豆苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、小檗碱、药根碱、巴马汀、甘草苷、甘草酸的加样回收率别离为.05%、.20%、.08%、99.21%、97.92%、.37%、99.92%、99.66%、99.84%、99.97%，RSD值别离为0.%、0.87%、1.69%、1.96%、1.65%、0.88%、1.73%、1.77%、0.93%、0.42%。
（6）含量测定：制备3批葛根芩连汤，每批平行测定3次，进样测定峰面积，谋略各批次各成份含量，成效表明葛根素、大豆苷、甘草苷、药根碱、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的原料分数别离为1.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.μg/g，RSD值别离为1.45%、0.21%、0.31%、0.15%、2.48%、0.26%、0.25%、0.10%、0.31%、0.06%。
2.2树立UCRCC疾病与NF-κB通路的交互网络模子挑选关键炎症因子
经历Pubmed、ScienceDirect、WebofScience、CNKI等关键数据库，别离查阅UCRCC疾病、NF-κB通路的高低游卵白，采取Cytoscape软件别离将NF-κB与UCRCC的高低游卵白做为肇端和止境，所树立NF-κB通路与UCRCC的交互影响网络如图2所示，根据Betweenness和Degree两项目标，估计NF-κB与UCRCC交互影响的关键卵白，个中归纳排名较高的前8位炎症因子别离是核因子-p65（NF-κBp65）、引诱型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管内皮细胞黏附分子1（VCAM-1）。以此为根据，后续熟练将对以上8项目标施行测定。
2.3葛根芩连汤对关键炎症因子的影响
2.3.1葛根芩连汤的制备同“2.1.3”项下法子。
2.3.2目标成份组合物的制备根据所测定成份在复方中的比例施行组方。精湛称定葛根素1.20mg、大豆苷1.05mg、黄芩苷1.08mg、黄芩素1.13mg、汉黄芩素1.04mg、盐酸小檗碱0.96mg、盐酸药根碱0.99mg、盐酸巴马汀1.15mg、甘草苷0.98mg、甘草酸1.06mg，溶于1mL甲醇中，获得目标成份组合物溶液。
2.3.3分组、造模及给药小鼠适应性喂养1周后，随机分为对比组，模子组，葛根芩连汤低、中、高剂量（成年人以70kg计，临床剂量为48g/d，按小鼠与人体表面积比值折算，小鼠ig给药的低、中、高剂量别离为3.12、6.23、12.46g/kg，别离相当于临床剂量的0.5、1、2倍）组，葛根芩连汤目标成份组合物组，5-ASA（临床剂量为0.58g/d，按小鼠与人体表面积比值折算，小鼠ig给药方量为0.g/kg）组，每组8只。造模第1周，小鼠ip10mg/kgAOM（用灭菌水熔解），第2周予以含有2%DSS（用灭菌水熔解）的饮用水，自在饮用4d，然后予以一般饮用水，逐日察看动物状况，称定原料，至第3周末，为第1个周期轮回；第4周开端为第2个周期轮回；第7周开端为第3个周期轮回，制备UCRCC模子。药物以水熔解配制成响应浓度的溶液，自造模同时，别离于第2、5、8周开端，各给药组逐日按剂量ig予以药物，给药体积为10mL/kg，对比组和模子组均ig等体积蒸馏水，1次/d，赓续2周。末了1个周期安歇10d后正法集体小鼠，取血及结肠机关[19]。
2.3.4葛根芩连汤及其目标成份组合物对UCRCC小鼠血清炎性因子程度的影响取小鼠血样，按酶联免疫试剂盒表明测定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1程度。成效如表2所示，与对比组对比，模子组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1程度均显著抬高（P＜0.01）；与模子组对比，葛根芩连汤各剂量组、目标成份组合物组以及5-ASA组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1程度均显著消沉（P＜0.05、0.01）。
2.3.5葛根芩连汤及其目标成份组合物对UCRCC小鼠结肠机关病理变动的影响将小鼠结肠机关于4%多聚甲醛中稳固，后续脱水、白腊包埋，赓续切片，厚4μm，施行HE染色，于光学显微镜下察看各组小鼠结肠机关病理变动。成效如图3所示，对比组小鼠结肠黏膜上皮完好，黏膜下血管显然，腺体摆列整洁，无溃疡孕育。模子组小鼠结肠黏膜上皮零落，腺体摆列杂乱，部份腺体有大局限摧残，黏膜层内有大批炎性细胞浸湿，核深染，部份核显然延长，部份腺体摆列杂乱，部份看来增生。葛根芩连汤中、高剂量组、目标成份组合物组及5-ASA组大鼠结肠黏膜上皮大部份增生修理，摆列较整洁，少许炎细胞浸湿。葛根芩连汤低剂量组小鼠结肠黏膜上皮有较大缺损，部份腺体增生，黏膜基层仍看来较多炎性细胞浸湿。
2.3.6葛根芩连汤及其目标成份组合物对UCRCC小鼠结肠机关炎性因子程度的影响将小鼠结肠机关置于4%多聚甲醛中稳固，后续脱水、包埋和切片，加兔抗抗体（按1∶稀释），4℃恒温住宿后，37℃下滴加二抗孵育30min。PBS清洗3次，屡屡3min，用滤纸去除有余水份，配制新鲜AEC显色，于光学显微镜下察看。成效如图4和表3所示，与对比组对比，模子组小鼠结肠机关中NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2卵白抒发程度均显著抬高（P＜0.01）；与模子组对比，葛根芩连汤低、中、高剂量组、目标成份组合物组以及5-ASA组NF-κBp65、iNOS、Bcl-2、COX-2卵白抒发程度均显著消沉（P＜0.01）。
3商议
据统计，现在寰球UC的病发率为（1～2）/万，跟着UC染病率的陆续高涨，对UCRCC的诊疗和干扰日趋成为该范畴的热门题目[15]。个中，对非可控性炎症恶性变化的调控是要紧科知识题。炎症响应在肿瘤产生、进展、恶性变化、进犯和变化等不同阶段起决议性影响，做为枢纽重心的NF-κB则是炎症恶性变化的要紧成分之一[17-18]。激活的NF-κB记号紧要经历调度癌基因机能；按捺肿瘤细胞凋亡、推进肿瘤细胞增殖；调控肿瘤细胞周期；调控肿瘤细胞进犯、黏附、变化、血管孕育关联记号因子的抒发；调控其余记号通路，使细胞去分裂，孕育肿瘤肇端细胞等方法来影响肿瘤的产生进展。大批研讨证明，NF-κB既是UC的关键道路，也是UCRCC的要紧通路。通路中的普遍记号因子既推进UC的进展，也介入UCRCC的产生进展[19,21-30]。Greten等的研讨成效表明，UCRCC模子小鼠结肠黏膜中NF-κB抒发上调，按捺NF-κB通路可显然增加结肠炎症及肿瘤的孕育，IKKβ基因敲除小鼠肿瘤孕育的数目也显然增加，IKK/NF-κB通路的奇异性失活可增加炎症关联肿瘤的孕育[31-32]。课题组前期研讨表明，葛根芩连汤及其药效物资经历NF-κB记号通路干扰UC，估计葛根芩连汤或者也经历该通路干扰UCRCC。
连年来，中药科技做事者针对中药原料管制做了大批研讨做事。跟着新本领、新本领的运用，中药原料管制研讨程度获得了很大提拔，如树立了基于中药药效物资挑选与辨识的原料管制形式、基于体内流程的中药质控形式、基于谱效相干为指点的中药质控形式、基于生物学本领的中药原料管制思绪以及基于谋略机新本领的中药质控形式等。上述研讨思绪是中药原料管制范畴的阶段性成效，对中药进展起到了精良的助推影响，但仍存在很多题目，如质控目标与中药的平安性、有用性关联性不强，有用性目标怎么抉择，研讨思绪、法子怎么有用调度等[33-34]。跟着Q-marker的提议，涌现了调度多种研讨思绪的“基于中药原料标识物的质控形式”，为中药原料管制提议了新的研讨形式与思绪，有益于树立中药全程原料管制编制。中药原料标识物是指存在于中药材和中药产物中固有的或加工制备流程中孕育的、与中药的机能属性亲密关联的化学物资，可做为响应中药平安性和有用性的标示性物资施行原料管制；而不是经历生物体内流程被吸取的化学物资和所孕育的化学物资，须要经历布局解析断定其化学布局，并可施行定性定量的特有的化学成份。中药原料标识物的根基前提是中药材和中药产物中固有存在的或加工制备流程中孕育的化学物资，与中药机能属性亲密关联，即有用性和可控性[6]。是以，本研讨
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