FFPE空转系列小课堂开课啦！
为更好地帮助大家更好的理解VisiumFFPE测序技术，得到完美的组织切片和优质的数据分析结果，本期开始，小编将为大家详细介绍VisiumFFPE测序的样本制备、实验流程、文章解读等信息~
VisiumFFPE实验流程
年，全新VisiumFFPE聚焦石蜡样本，获取珍贵历史样本中的基因表达信息，其实验流程对比冰冻组织的空间转录组也有所调整，一起来了解一下吧~
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沿袭冰冻组织空间转录组实验，VisiumFFPE测序也需要对组织进行切片，因此客户提供样本时，可以是前期保存的石蜡组织块，或取新鲜组织用石蜡包埋。后续切片、质控、RNA信息捕获及文库构建和生信数据分析等工作，全部由烈冰完成，具体实验流程如下：
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01样本准备
VisiumFFPE样本制备包含组织石蜡包埋，切片，贴片等过程。
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FFPE样本切片厚度一般为5μm（区别于冰冻组织样本的10μm），切片样本大小不宜超过6.5mm×6.5mm（载玻片的大小），超出的部分无法被捕获到，反而可能会影响其他样本空间信息。
组织样本太大怎么办？可以根据不同病变区域分为多个样本。例如，肿瘤组织可以分为中心/边缘/正常组织进行切片观察。
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02质控
FFPE样本质控包含两个部分：1.RNA质量。2.切片粘附性
由于FFPE样本的RNA质量较差，RIN值无法用于RNA的质控衡量标准。因此，FFPE样本的RNA质检标准以DV%为最低要求。DV是指长度大于nt的RNA片段占总的RNA片段的比例。
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另外，对每个FFPE样本，都需要做FFPE贴片粘附性实验。通过切片脱蜡染色再复水，显微成像观察脱片情况，保证正式实验样本切片能牢固的粘附在玻片上，防止后续实验过程中加各种试剂或洗涤浸水导致切片脱落。
0贴片
对质控合格的样本进行正式试验时，利用切片机，展片机（恒温）和烘片机等设备，将切片组织贴在玻片上，烘片机烘干玻片，干燥剂密封过夜等操作，保证样本切片牢固的粘附在玻片上。
Tips:贴片时组织不要盖住玻片的四个角；贴片无折叠和褶皱，防止玻片和切片间存在气泡。
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04染色
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FFPE切片除HE染色可观察组织形态和病理结构外，还可以在正式实验切片上进行免疫荧光染色，实现蛋白质与RNA的共检测或与HE染色相结合来观察形态背景。
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05探针杂交
针对FFPE样本中的RNA降解问题，VisiumFFPE针对每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe以靶定RNA的特定序列，通过probe与组织内RNA杂交，将RNA信息转移到probe上，再将探针两端连接形成完整的DNA链。之后降解杂合RNA链，透化释放连接的probe，完成信息捕获过程。
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06探针延伸回收建库
捕获的probe在玻片上进行延伸反应，生成cDNA，回收单链cDNA并构建测序文库进行上机测序，从而获取基因表达信息。
基于探针设计捕获方式，FFPE样本文库构建大小在bp左右（区别于冰冻组织），测序深度在25kreadspair/perspot左右即可满足分析需要（区别于冰冻组织50kreadspair/perspot）的要求。
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VisiumFFPE和Visium实验比较
总的来说，VisiumFFPE实验过程相较于冰冻切片组织实验，操作更为繁琐，耗时也相对更长，但该技术的出现，使得长期保存的珍贵组织样本基因表达信息获得重现，实现病理图像化和基因数字化的完美结合！
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烈冰市场部/撰文
部分图片来源10X官方
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