前言
年7月希伯来大学医学中心GiladW.Vainer团队在MolecularCellularProteomics发表了题为“NovelProteomeExtractionMethodIllustratesaConservedImmunologicalSignatureofMSI-HColorectalTumors”的研究成果，通过建立更为简洁且环保的FFPE样本蛋白提取方法，对微卫星稳定和不稳定的结直肠癌样本进行非标记蛋白质组学分析，结果揭示了肿瘤细胞在长期体内免疫压力下所经历的变化。产生的数据为寻找新的临床生物标志物和治疗方法提供了宝贵资源。
中文标题：新型蛋白质组提取方法阐明了MSI-H结直肠肿瘤的保守免疫学特征
研究对象：结直肠肿瘤
发表期刊：MolecularCellularProteomics
影响因子：4.87
发表时间：年7月
运用生物技术：非标记定量蛋白质组学（福尔马林固定和石蜡包埋临床组织样本）
研究背景
分子病理学的重大突破之一是从福尔马林固定和石蜡包埋（formalin-fixedandparaffin-embedded,FFPE）的临床组织中有效提取DNA和RNA。尽管已有方法可以提取FFPE样本中的蛋白质[1]，但仍然存在诸多问题[2]。主要问题之一是临床中组织固定时间的巨大差异，由于蛋白质的回收率随着固定时间的延长而下降，因此不同的组织固定时间得到的蛋白质组学结果差异较大。建立稳健、有效且不受固定时间影响的蛋白质提取方法将有助于推动临床蛋白质组学的发展。
结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是一种常见的癌症，其基因组不稳定是关键的发展因素之一。基因组不稳定性的两种主要形式：染色体不稳定性和微卫星不稳定性（microsatelliteinstability,MSI）控制着这一过程。大多数CRC病例的特征是染色体不稳定且微卫星稳定（microsatellitestability,MSS）。然而约5-15％的CRC是微卫星高度不稳定性（MSI-H）。MSI-H肿瘤，也称为错配修复缺陷（mismatchrepairdeficient,MMRd），由DNA错配修复蛋白的缺乏而发展。MSI-H肿瘤会产生可能充当新抗原的异常蛋白，并触发针对肿瘤的有效免疫反应。越来越多的证据表明MSI-H肿瘤细胞与免疫微环境之间存在独特而复杂的相互作用。
研究思路
研究结果
1、FFPE蛋白质组提取的优化
临床中福尔马林的固定时间差异较大，较长的固定时间对从临床FFPE样品中提取的蛋白数量产生有害影响，从而影响了质谱检测的蛋白质组覆盖率。本文作者为最小化固定时间对蛋白质组学结果的影响，更改了FFPE蛋白质组提取的几个步骤：
1.使用矿物油(mineraloil)进行脱蜡，免除了传统方法中有毒的有机溶剂和多次洗涤。
2.升高温度和压力（c，15psi），有助于蛋白质提取过程。
作者将此方法命名为TOP(Temperature-Oil-Pressure)法。作者使用一组在福尔马林中固定2或8天的匹配组织，比较了传统方法和TOP法的蛋白质组结果（每组3次重复）。如图2A示，共鉴定到种蛋白质（3肽段），传统方法8天固定组的蛋白数量最少，Pearson相关性分析表明传统方法8天组与其他组的相关性较低（图2B）。使用12个样品共同鉴定到的种蛋白质进行相关性分析也是同样的结果（图2C）。
图2
与传统提取方法相比，TOP方法对福尔马林固定导致的偏差更具抵抗力
（A）蛋白质鉴定数；
（B）种蛋白的Pearson相关性热图；
（C）12个样本中共同鉴定到的种蛋白的Pearson相关性热图；
2、结直肠癌样本的无监督聚类
作者使用TOP法对FFPE结直肠癌样品进行蛋白提取和蛋白质组学非标定量分析。检测的19个样品中8个是MSI-H（42％）。结果共鉴定到种蛋白质，其中种蛋白质在所有的样本中共同鉴定到。无监督分层聚类显示了两个主要的类别群（图3）。一类包含MSI-H样本（8个中的7个），另一类包含MSS样本（11个中的8个）。且来自同一肿瘤不同区域的样本聚集在一起（样本和；图3）。这些结果表明，优化后的临床蛋白质组学可以产生一致且高质量的数据，并且肿瘤蛋白质组反映了MSI的状态。
图3
无监督层次聚类
3、MSI-H肿瘤过表达STAT1和许多免疫相关蛋白
差异蛋白分析发现，与MSS组相比，MSI-H组中有67种蛋白上调，35种蛋白下调（图4A）。使用STRING数据库进行蛋白质相互作用分析，发现MSS肿瘤过表达的35种蛋白质没有统计学上的显著富集。而MSI-H过表达的蛋白质具有高度显著的连接富集（图4B）。此外，发现约33％的蛋白质（65种中的22种）与免疫应答过程有关（图4C），特别是与干扰素-γ介导的信号传导途径（图4D）和抗原加工呈递有关。差异蛋白列表中包含STAT1蛋白，这是包括干扰素-γ信号传导在内的许多免疫过程中的关键转录因子。综上所述，MSI-H肿瘤过表达的蛋白质高度富集并与免疫系统有关。
图4
差异蛋白分析
（A）差异蛋白形成的有监督聚类结果；
（B）67种MSI-H组过表达蛋白的相互作用；
（C）22种蛋白质与免疫应答有关；
（D）5种蛋白质与干扰素-γ介导的信号通路有关；
4.MSI-H结直肠肿瘤细胞异常表达MHC-II受体
为了确定蛋白质组学数据中的差异蛋白是由肿瘤细胞还是基质细胞表达，作者对几种候选蛋白进行了免疫组化分析。由于MHC-II蛋白通常在上皮细胞中不表达，且MSI-H肿瘤细胞中曾报道为阳性，因此作者分析了5个MSS和4个MSI-H肿瘤中MHC-II蛋白的免疫组化（图5A）。结果显示基质淋巴细胞在MSS和MSI-H肿瘤中均表达HLA-DPB1，HLA-DQB1和CD74，其可作为内部阳性对照。但是仅在MSI-H样品中发现了具有弥散性(diffuse)、细胞质(cytoplasmatic)和膜状(membranous)阳性的肿瘤细胞（图5）。免疫组化结果表明免疫学特征主要由肿瘤细胞驱动。此外，它强调了MSI-H肿瘤细胞对MHC-II（免疫检查点LAG-3的配体）的高表达。
图5
免疫组化表明MSI-H肿瘤细胞表达MHCII型成分
5.只有STAT1水平与干扰素-γ信号传导相关
人STAT蛋白家族有7个成员。暴露于干扰素-γ后，磷酸化STAT1和STAT3的含量增加，转移到细胞核中起转录激活剂的作用。对Pearson相关矩阵进行无监督聚类，作者发现61种蛋白聚在STAT1附近（图6）。GO功能富集的前三个过程均与免疫相关（图6C）。此外，总STAT1水平与干扰素-γ介导的信号通路和吞噬体相关。对STAT3分析发现聚集了54种蛋白质，但是与STAT3相关的生物学过程和STAT1的完全不同。结果表明STAT家族蛋白与不同的蛋白和生物学过程相关，仅STAT1蛋白水平与区分MSI-H和MSS肿瘤的相同免疫过程相关。
图6
Pearson相关性矩阵的无监督聚类
6.长时间暴露于干扰素-γ可区分STAT1与STAT3
接着作者在不断增加的干扰素-γ存在下培养了微卫星不稳定的人CRC细胞DLD1和RKO，观察到STAT1和STAT3的磷酸化水平和总量增加。通过对比短期（1天）或长期（1周）的干扰素-γ暴露，发现一天后总STAT3水平趋于稳定，而在一日暴露和一周暴露之间STAT1水平持续上升（图7A）。接着作者研究了干扰素-γ在癌细胞中诱导的时间蛋白质组学变化。通过对暴露于干扰素-γ一天，一周和对照组的DLD1细胞进行蛋白质组分析，鉴定并定量了包括STAT1和STAT3在内的种蛋白质，样本相关性分析表明对照组和IFN-g1周组显示出最大的差异，而INF-g1天组在两者之间（图7B）。此外无监督的主成分分析结果与实验设计相匹配（图7C）。
图7
长期接触IFNg导致STAT1水平继续上调
7.暴露于干扰素-γ触发复杂的时间蛋白质组变化
对上述3组间进行差异蛋白分析，发现16.1％的蛋白质组（/蛋白）差异表达。这些蛋白质的层次聚类清楚地显示了时间变化（图8），并突出了复杂的时间行为。
图8
差异表达蛋白的监督层次聚类
相关讨论
作者优化了FFPE样本提取方法，该方法适用于较宽的福尔马林固定时间。此外，新方法简化了样品制备步骤，且升高的温度和压力有效地溶解了蛋白质。与使用有机溶剂的传统方法相反，TOP方法使用的无害、环保的试剂。从FFPE切割开始约3个小时即可完成蛋白质组提取，且无需通风橱。
使用TOP方法和19个FFPE组织，作者建立了结直肠癌临床蛋白质组数据，鉴定和定量超过种蛋白质。无监督分层聚类表明MSS和MSI-H患者的蛋白质组是不同的。进一步分析显示大多数由MSI-H肿瘤过表达的蛋白质与免疫系统相关的过程有关，其中包括抗原的加工和呈递。免疫组化结果表明肿瘤细胞而非基质是造成MHC-II异常表达的原因，MHC-II是免疫检查点蛋白LAG-3的配体。值得注意的是，STAT1被MSI-H肿瘤细胞过表达。在结直肠癌中，STAT1的作用是复杂的。MSI-H肿瘤细胞异常表达MHC-II复合物，而STAT1调节CIITA转录（干扰素-γ引起MHC-II表达的关键诱导剂）。综上数据表明STAT1高表达与免疫逃逸之间存在联系。
研究结论
临床蛋白质组学已显著成熟，优化的流程将继续增进我们对人类疾病的了解。作者通过对FFPE样本提取蛋白流程的优化，结合临床样本证明MSI-H结直肠肿瘤表达高水平的STAT1。研究结果指出了CRCMSI-H肿瘤的一种免疫逃逸机制，该发现可能有助于进一步的药物开发。
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临床蛋白质组学对疾病生物标志物、药靶研究、疾病机理、精准医学等研究领域至关重要。FFPE可以在常温保留很久，是医院里最常用的样本储存手段。虽然当前已有FFPE蛋白提取方法，但还存在优化的空间。本文作者针对长时间固定导致FFPE蛋白质组鉴定蛋白数量少的问题，提出了优化的蛋白提取方法。结合临床结直肠癌样本，探索了MSI-H与MSS结直肠癌的蛋白质组学差异，发现了MSI-H肿瘤过表达STAT1和免疫相关蛋白，其提出的FFPE蛋白提取方法和实验思路值得借鉴和参考。
文末看点
本文对福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）的临床组织研究，建立稳健、有效且不受固定时间影响的蛋白质提取方法推动了临床蛋白质组学的发展。
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参考文献：
[1]Ostasiewicz,P.,D.F.Zielinska,M.Mann,etal.,Proteome,phosphoproteome,andN-glycoproteomearequantitativelypreservedinformalin-fixedparaffin-embeddedtissueandanalyzablebyhigh-resolutionmassspectrometry.JProteomeRes,.9(7):p.-.
[2]Giusti,L.,C.Angeloni,andA.Lucacchini,Updateonproteomicstudiesofformalin-fixedparaffin-embeddedtissues.ExpertRevProteomics,.16(6):p.-.
[3]ElezD.Vainer，JulianeKaniaAlmog，GhadeerZatara，YishaiLevin，GiladW.Vainer.NovelProteomeExtractionMethodIllustratesaConservedImmunologicalSignatureofMSI-HColorectalTumors.MolCellProteomics.Oct;19(10):-.
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